HPLC法同时测定复方利血平片中苯磺酸氨氯地平和缬沙坦含量

张 芳(内蒙古医学院第一附属医院药剂科，呼和浩特 010050)

复方制剂由于药物间产生协同作用，从而减少不良反应和用药制剂的数量，改善患者的顺应性，正日益受到国内外的关注。由于复方制剂成分较复杂，且各成分理化性质不同，其含量测定较为困难。本文中的复方抗高血压药由钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦2种活性成分组成，该复方制剂中各单一成分的含量测定方法已有文献报道，但2种成分同时进行含量测定的方法还未见报道。笔者通过大量试验，建立了一种用高效液相色谱法法同时测定复方利血平片中2个主要成分的含量的方法，为该类制剂研究质量控制中含量测定方法提供了一种思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(型号:Agilent1100;生产厂家:安捷伦公司)，包括泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、VWD紫外检测器、HP化学工作站;电子分析天平(型号:AL104;生产厂家:梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品:苯磺酸氨氯地平和缬沙坦对照品，均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为:100374-200602和100651-200401;样品:复方利血平片，自制，批号分别为:090601、090602、090603;甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(5 μm，4.6 ×250 mm);流动相:甲醇-0.2%磷酸(70∶30);检测波长:237 nm;流速:1 mL·min－1;柱温:25 ℃;进样体积:20 μL[1，2]。

2.2 溶液的制备及测定方法

2.2.1 供试品溶液的制备:取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于缬沙坦40 mg)，置100 mL量瓶中，加流动相80 mL，超声处理10 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液[1，2]。

2.2.2 对照品溶液的制备:取苯磺酸氨氯地平对照品与缬沙坦对照品各适量，加流动相溶解并稀释成每1 mL含苯磺酸氨氯地平3.5 μg、缬沙坦80 μg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 测定方法:精密量取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，即得。

2.3 系统适用性试验

精密吸取上述对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色图谱，计算理论塔板数，分离度。结果在选定的色谱条件下，经反复试验，理论板数按苯磺酸氨氯地平和缬沙坦峰计算，均在3 000以上，且2种成分与相邻色谱峰的分离度均符合《中华人民共和国药典》(2010年版)附录的规定[3]。

2.4 专属性试验

按处方比例，制备空白辅料及缺苯磺酸氨氯地平和缺缬沙坦的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制备上述阴性样品溶液，在选定的色谱条件下进样，结果空白辅料及阴性样品对2组分测定均无影响。对照品、供试品及阴性样品色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram

2.5 色谱条件的系统适用性考察

为了进一步考察本色谱条件的系统适用性，考察了本品在剧烈条件下的降解情况，用高温、酸、碱、氧化等方式对本品进行破坏后，考察对主要成分的分离效果。结果:本品中的苯磺酸氨氯地平和缬沙坦2种成分与所有破坏试验产生的杂质的分离度均大于1.5，符合《中华人民共和国药典》(2010年版)附录ⅤD法系统适用性试验要求;说明本色谱条件可作为本制剂的含量测定方法[3]。

2.6 线性范围的考察

精密称取苯磺酸氨氯地平对照品和缬沙坦对照品适量，加流动相溶解并稀释成每1 mL溶液中含苯磺酸氨氯地平17.34 μg和缬沙坦0.401 5 mg的混合溶液，作为对照品溶液，分别精密吸取上述溶液 1、2、4、6、8、10 μL 注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积作纵坐标，进样量(μg)作横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程[苯磺酸氨氯地平:Y=198 3.84X－1.79(r=0.999 94);缬沙坦:Y=2 104.98X+9.87(r=0.999 99)]，结果表明:苯磺酸氨氯地平在0.017 34～0.173 4 μg、缬沙坦在 0.401 5 ～4.015 μg 范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取同一供试品溶液20 μL，连续进样6次，记录峰面积，结果苯磺酸氨氯地平RSD=0.44%，缬沙坦RSD=0.15%。

2.8 溶液稳定性试验

取“2.2 项”下的供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8 h 进样，记录峰面积，结果苯磺酸氨氯地平 RSD=0.79%，缬沙坦RSD=0.17%。结果表明:供试品溶液在8 h内稳定。

2.9 重复性试验

取同一批号样品(批号:090603)粉末适量(约相当于缬沙坦40 mg)，平行称取6份，照“2.1、2.2”项下方法测定含量，结果苯磺酸氨氯地平RSD=1.81%，缬沙坦RSD=1.45%。

2.10 回收率试验

按处方比例，称取空白辅料9份，分别置100 mL量瓶中，分别精密加入缬沙坦对照品和苯磺酸氨氯地平对照品适量，加流动相适量，超声处理10 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，以下操作按“2.1、2.2”项下方法测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests

2.11 耐用性试验

在选定的色谱条件的基础上，分别考察了不同型号的色谱柱及改变流动相比例，对2组分分离效果及含量的影响。色谱柱试验了 Agilent Eclipse Plus C18(5 μm，4.6×250 mm)和 Agilent Eclipse XDB C18(5 μm，4.6×250 mm，)，结果分离效果基本一致。流动相比例分别试验了甲醇-0.2%磷酸75∶25、70∶30 和65∶35，结果 2 组分的分离效果及含量基本一致，表明色谱条件稍有改变，不会影响测定结果。

2.12 定量限检测

因处方中苯磺酸氨氯地平量较少，故对其定量限进行了考察。方法:精密称取苯磺酸氨氯地平对照品适量，加流动相溶解并稀释成每1 mL含0.88 μg的溶液，分别精密吸取此溶液 2、5、10、20 μL，注入液相色谱仪，按《中华人民共和国药典》(2010年版)附录对定量限确定的要求，以信噪比10∶1时的进样量来确定，结果进样量为0.008 8 μg时符合要求，并对精密度试验进行了考察，即配制了每1 mL含0.43 μg的苯磺酸氨氯地平对照品溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，RSD=0.99%。结果表明:检测的精密度较好，符合定量限要求，故确定苯磺酸氨氯地平的定量限为0.008 8 μg[3]。

2.13 样品测定

对3批样品按拟定的含量测定方法进行测定，按外标法计算标示量的百分含量，3批样品含量测定结果见表2。

表2 3批样品含量测定结果(n=3)Tab 2 Determination results of the contents of three batches of samples(n=3)

3 讨论

3.1 复方抗高血压药的临床应用趋势

对于许多高血压患者，仅仅使用单方难以控制的高血压，这就需要作用机理不同的抗高血压药联合使用把血压降到预期的效果，这样不仅可以减少由于单方时增加药物剂量带来的不良反应，而且降压效果会比其中的任何单方强，复方制剂消除联合用药的麻烦，也减少了漏服的可能性。有研究表明，近80%的高血压患者需要多药联合治疗，以帮助血压达标。对于那些需要多种药物治疗的患者，采用固定复方制剂作为一线治疗方案可以避免由一种药物开始治疗，接着增加剂量，继而再加用另一种药物的阶梯治疗方案，从而可以减轻患者的用药治疗负担，目前联合用药是国际和我国高血压防治指南共同提倡的。所以，复方制剂的研究对增加疗效准确、适应证广的抗高血压药新品种，更好地满足临床需求有着重要意义[4-7]。

3.2 含量测定方法选择

在选择色谱条件时，流动相的选择首先参照苯磺酸氨氯地平和缬沙坦原料及单方制剂的质量标准，流动相曾试验了乙腈-水-冰醋酸(500∶500∶1)、甲醇-0.03 mol·L－1磷酸二氢钾(75∶25)、乙腈-0.2%磷酸及乙腈-0.2%磷酸(用三乙胺调节pH值)等系统及不同比例，结果以乙腈-0.2%磷酸(三乙胺调节PH值为2～3)分离效果较好，后又试验了甲醇-0.2%磷酸(70∶30)，结果分离效果较好，且2组分的保留时间适宜，故将此流动相收入正文。在选择检测波长时，经光谱图考察、缬沙坦在250 nm有最大吸收，而苯磺酸氨氯地平在237 nm有最大吸收，因处方中缬沙坦处方量较苯磺酸氨氯地平的大，故选择237 nm作为检测波长，同时检测2种成分;而在此波长处，缬沙坦也有较强的吸收。在制备供试品溶液时，对提取溶剂及提取方法进行了选择。提取溶剂根据苯磺酸氨氯地平和缬沙坦的理化性质，并参照文献，曾试验了以甲醇和流动相为溶剂，结果:甲醇和流动相为溶剂时，2种成分的含量稍有差异，并且以甲醇为溶剂时，苯磺酸氨氯地平和缬沙坦的理论板数较低，且峰形均较差，故选择流动相作为提取溶剂。提取方法参照苯磺酸氨氯地平和缬沙坦单方制剂原标准含量测定项下均采用超声处理方法进行提取效果较好。超声时间分别试验了10、20、30 min，结果无明显差别，故选择超声10 min即可。

该方法通过对精密度、稳定性、重现性、回收率试验及3批样品中苯磺酸氨氯地平及缬沙坦的含量测定，证明本方法作为该药品含量测定方法，能够保证检测时数据的真实性、可靠性，可有效控制该制剂含量，能够作为保证药品质量的检测依据。

[1]国家食品药品监督管理局．国家药品标准[S]．WS1-(X-228)-2004Z，WS1-(X-239)-2003Z．

[2]安富荣，沈金芳．国产与进口缬沙坦胶囊的质量评价[J]．中国药房，2007，18(4):291.

[3]国家药典委员会．中华人民共和国药典:二部[S]．2010年版．北京:中国医药科技出版社，2010:附录29．

[4]田 硕，高云颂，李南屏．缬沙坦单用及其与非洛地平联用治疗高血压疗效观察[J]．世界临床药物，2008，29(6):366.

[5]陆祖祥，吴家华，胡先进，等．血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦临床应用进展[J]．中国全科医学，2004，7(16):1153.

[6]赵乐平，虞旭东．不同剂量氨氯地平及联合厄贝沙坦治疗原发性高血压的疗效和耐受性[J]．医药导报，2008，27(4):417.

[7]《中国高血压防治指南》(基层版)编撰委员会．中国高血压防治指南(2009年基层版)[M]．北京:人民卫生出版社，2010.