HPLC-ELSD测定天王补心丸中酸枣仁皂苷A的含量

何新荣，刘 萍，孙 艳(解放军总医院中药房，北京 100853)

天王补心丸，主要成份为地黄、酸枣仁、麦冬、天冬、五味子等，主要功效为滋阴养血，补心安神。用于心阴不足，心悸健忘，失眠多梦，大便干燥[1]。天王补心丸处方中，酸枣仁养心安神[2]，而且酸枣仁及酸枣仁皂苷的安神药理作用已有诸多报道[3，4]，但其制剂标准只对五味子醇甲进行了含量测定，为了更科学地控制天王补心丸的质量，本文对其酸枣仁皂苷A的含量进行了测定，为其质量控制提供科学有效的方法。

有关中药饮片及其制剂中酸枣仁皂苷的含量测定已有较多报道[5-9]，但目前未见对天王补心丸中酸枣仁皂苷A含量的分析报道，本文采用HPLC-ELSD测定天王补心丸中酸枣仁皂苷A含量，方法快速简便、稳定可靠，适用于天王补心丸中酸枣仁皂苷A的定量分析及质量标准的研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国)，G1329A自动进样器，数据由Agilent Chemstation on-line系统处理，蒸发光检测器(ELSD，Alltech 3300)，色谱柱为 Agilent TC(2)-C18柱(250× 4.6 mm，5 μm)。电子天平 (Sartorius CP225D);KQ2200DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器);SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药

酸枣仁皂苷A对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110734-200407);天王补心丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号:8015117，8015079，9015317);甲醇(色谱醇);水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent TC(2)-C18色谱柱(4.6 × 250 mm，5 μm，Agilent Technologies)，流 动 相 为 甲 醇-水 (梯 度 洗 脱)，流 速1.0 mL·min－1，柱温:30℃;ELSD检测雾化温度45℃，气体流速为 1.6 L·min－1。流动相:最初 5 min 为甲醇-水(70∶30)，5～30 min甲醇的浓度上升到80%并维持此比例5 min，3 min回到原始比例并平衡10 min。

2.2 标准曲线的制备

精密称取酸枣仁皂苷A对照品2.25 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀即得0.45 mg·mL－1对照品贮备溶液。精密吸取对照品贮备溶液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6)mL定溶到2 mL，作为酸枣仁皂苷A标准品对照溶液，分别进样20 μL测定。以酸枣仁皂苷A浓度为横坐标(X)，峰面积的为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得线性回归方程为:lgY=1.324 9 lgX+0.239 2，r2=0.999 6(n=5)。结果表明，酸枣仁皂苷A在22.5～360 μg·mL－1范围内与峰面积的对数值呈良好的线性关系。

2.3 供试品溶液的制备

称取天王补心丸(批号:8015079)，将大蜜丸剪碎、混匀，精密称取10 g，加入两倍量的硅藻土，研匀，精密称定置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷至室温，称重并加甲醇至始重，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液，即得。其他两个批次类此制备供试品溶液，备用。

2.4 阴性对照试验

按天王补心丸制备工艺制备缺酸枣仁药材的阴性样品，并照“2.3”项下处理方法制成阴性对照品溶液，备用。供试品溶液、阴性对照品溶液，标准品对照溶液各20 μL分别进样，结果表明，在与酸枣仁皂苷A对照品色谱峰(见图1中图C)相应位置上，供试品色谱图中显示相同保留时间的色谱峰;而阴性对照溶液在此保留时间处无色谱峰出现，表明阴性对照液无干扰，见图1。

图1 HPLC-ELSD色谱图Fig 1 HPLC-ELSD chromatograms

2.5 精密度试验

分别吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL，按上述色谱条件，各重复进样5次，测定峰面积积分值，计算RSD值。对照品溶液RSD=0.41%，供试品溶液RSD=1.08%。

2.6 重复性试验

取同一批(批号:8015079，含量:0.271 8 mg·g－1)5 份，按照“2.3”项下依法平行制备供试品溶液，测定每份供试品中含量，结果平均值为0.271 2 mg·g－1，RSD=2.19%。表明其方法重现性良好。

2.7 稳定性试验

在室温条件下，将2.3项下供试品提取液分别于提取后0、1、2、4、8、12(h)进样 1 次，共测定 6 次，测得酸枣仁皂苷 A峰面积的RSD=2.00%，表明在12 h内供试品溶液稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取已测知含量的同一批号的(批号:8015079，含量:0.271 8 mg·g－1)内容物约1.0 g，共6份，精密称定，分别加入精确吸取的2.2项下酸枣仁皂苷A标准贮备液0.5 mL(0.225 0 mg)、0.6 mL(0.270 0 mg)、0.7 mL(0.315 0 mg)，按照“2.3”项下制备供试品溶液，照上述高效液相色法测定，结果见表1。

表1 酸枣仁皂苷A加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery test of jujuboside A

2.9 样品的测定

精密称取3批天王补心丸样品，每批取3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，进样量20 μL，测定酸枣仁皂苷A的峰面积积分值，用外标法计算酸枣仁皂苷A的含量，结果见表2。

表2 天王补心丸中酸枣仁皂苷A的含量(n=3)Tab 2 Content of jujuboside A in Tianwang Buxin pill samples(n=3)

3 讨论

在供试品溶液的制备过程中，为了保证样品中酸枣仁皂苷A的充分提取，本实验考察了相关文献[6-8]报道方法后，采用加入70%乙醇[6]、90%甲醇、100%甲醇超声提取，并对不同提取时间进行了试验，结果表明，70%乙醇与90%甲醇提取含量相当;100%甲醇超声30 min，提取效果佳，无需复杂的提取工艺，较70%乙醇，90%甲醇提取完全。

本实验采用HPLC-ELSD测定酸枣仁皂苷A的含量，其方法提取完全，简便、快捷、稳定，杂质对分离无干扰，选择性较强，为天王补心丸的质量控制及含量测定建立一个可行的方法。同时，实验中还对样品中酸枣仁皂苷B进行了检测(此条件下皂苷B对照品的保留时间为18.32 min)，可能由于其含量低[10]和ELSD检测灵敏度限制，未能检测出。

样品检测中，曾以不同比例的乙腈-水，甲醇-水，甲醇-0.1%醋酸，甲醇-0.2%醋酸为流动相等度和梯度洗脱，结果表明，以甲醇-水，甲醇-0.2%醋酸梯度洗脱时分离效果均较好，其他条件酸枣仁皂苷A的色谱峰形不好，故最终采用此流动相。与文献[5，6]报道一致。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典:一部[S]．北京:中国医药科技出版社，2010:515.

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典·临床用药须知(中药卷)[S]．北京:人民卫生出版社，2005:475．

[3]陈百泉，杜钢军，许启泰．酸枣仁皂苷的镇静催眠作用[J]．中药材，2002，25(6):429.

[4]BAO Kang-De，LI Ping，LI Hui-Jun，et al．Simultaneous Determination of Flavonoids and Saponins in Semen Ziziphi Spinosae(Suanzaoren) by High Performance Liquid Chromatography with Evaporative Light Scattering Detection[J]．Chinese Journal of Natural Medicines，2009，7(1):47.

[5]陈 婧，刘焱文．HPLC-ELSD法测定酸枣仁汤中酸枣仁皂苷 A的含量[J]．中药材，2006，29(7):730.

[6]张彦青，解军波，张明春，等．HPLC-ELSD法测定酸枣仁滴丸中酸枣仁皂苷A、B和白桦脂酸[J]．中草药，2009，40(2):234.

[7]李会军，李 萍．高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A及B的含量[J]．药物分析杂志，2000，20(2):82.

[8]隋 宏，周慧玲，陈建峰，等．HPLC-ELSD测定酸枣仁合剂中酸枣仁皂苷A的含量[J]．现代食品与药品杂志，2007，17(6):35.

[9]张志斐，袁志芳，张兰桐，等．河北道地药材酸枣仁HPLC-ELSD 指纹图谱研究[J]．中草药，2007，37(8):1247.

[10]古 今，刘 萍．HPCE法测定酸枣仁及其伪品中酸枣仁皂苷B的含量[J]．中国药物应用与监测，2007，4(5):38.