肿瘤坏死因子超家族成员分子结构的研究进展

熊 娟(综述)，徐笑红(审校)

(浙江省肿瘤医院检验科，杭州310022)

细胞内外配体和受体的相互作用是多细胞生物维持生存和调控功能的基础，肿瘤坏死因子超家族成员(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)和其膜受体(tumor necrosis factor receptor，TNF-R)的相互作用是该调控途径中一个典范，不仅与机体免疫系统的功能及组织高度相关，且可能与一些获得性的免疫缺陷病及遗传基因病的病因学有关。体内有多种免疫活性因子(干扰素、白细胞介素等)即通过激活上调TNF-R以达到清除肿瘤细胞、减轻炎症效应、促进细胞凋亡的目的。它们发挥的生物学功能是复杂的，但两者均存在相似的结构，且相互作用位点是高度保守的，对其结构的深入了解有利于对其功能进行研究。

1 TNFSF

TNFSF的配体是由18个基因编码的Ⅱ型跨膜蛋白，具有共同的同源结构域(TNF homeodomains，THD)，位于羧基端，即胞外端。尽管TNF的大多数配体都是膜结合蛋白，但可溶性是其发挥其功能的必要条件，体内某些可溶性配体可被限制性蛋白水解酶水解，如金属蛋白酶作用于TNF和人核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANK)［1，2］，基质溶解因子作用于FasL［3］，枯草杆菌蛋白酶家族成员能作用于TNF的某些成员，如人可溶性B淋巴细胞刺激因子(B-cell activating factor，BAFF)、纤维连接蛋白(extradomain A，EDA)、人肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子(tumour necrosis factor related weak inducer of apoptosis，TWEAK)和增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand，APRIL)［4，5］。相反，一些膜结合配体的脱离会抑制其功能，如FasL遇到蛋白水解酶水解后，其细胞毒活性会大大减弱［6］;淋巴毒素(lymphotoxin，LT)的氨基端能模拟信号肽结构，使其顺利转变为可溶形式，故LT很少以膜结合蛋白的形式存在，除了其与LTβ结合成LT1β2二聚体。Zhang 等［7］研究发现，TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)被半胱氨酸蛋白酶水解后，由于水解产生的可溶片段太小，反而难以维持其功能的发挥。

研究发现，参与TNF家族调节免疫和炎症的配体反应在几个水平，其中LT、LTβ对次级淋巴器官的形态发生提供了重要的信号［8］，而B淋巴细胞有关的因子，如BAFF和CD40L可能参与免疫前体细胞的修饰和激活［9］，另外促凋亡相关基因的TNF家族配体(如FasL及TRAIL)可通过激活诱导细胞死亡发挥其细胞毒作用，并参与淋巴系统动态平衡［10］。此外，有研究表明有些配体在调节上皮细胞、内皮细胞和破骨细胞的成熟和分化中发挥重要的作用［11］。除了参与免疫调节，TNF家族成员与获得性或遗传性缺陷疾病也相关，在一些获得性免疫反应中，如败血症性休克或类风湿关节炎患者体内往往过表达一些TNF 家族［9］。

2 TNF家族配体的结构特点

THD是一个长约150个氨基酸的序列，包含芳香族和疏水性残基的保守骨架。不同TNF家族配体结构中的THD有着几乎完全相同的空间折叠构型，且与三聚蛋白形成密切相关。THD包含两个β–片层，每个β–片层由五个反向平行5个β折叠股构成。内层为A'、A、H、C和F折叠股，这一构型与三聚体形成密切相关;外层为E、D、G、B和B'结构域。三聚体中，每一个亚基的一个边缘(链E和F)与相邻的亚基的彼此相对，形成大的疏水界面，从而达到非常稳定的相互作用［12］。近年来，研究发现多数TNF家族配体均利用一个二硫键将CD和EF环链接在一起，在TRAIL中，EF环中可能存在一个单独的半胱氨酸残基(Cys230)参与协调锌离子，这种金属结合位点在肿瘤坏死因子家族中是唯一的，不仅对TRAIL稳定性和生物活性有重要影响，也有助于单体之间的相互配位［13］。Hao等［14］也赞同此观点，发现错误的结构配对，尤其是不完全的锌离子对位，局部氧化，和错误的二硫键链接在促进肿瘤细胞凋亡的同时可能造成严重的肝脏毒性。

3 TNF-R

在人类中，迄今确定有29种TNF-R，其中大部分是I型(胞外N末端，细胞内C端)跨膜蛋白，但也有例外，如B淋巴细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)、跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor，TACI)，BAFFR 和X-连锁性外胚层发育不良受体为Ⅲ型跨膜蛋白(缺乏一个信号多肽)，而凋亡诱导配体受体3(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 3，TRAIL-R3)则被一个共价键锚定在C-末端糖脂上，骨保护素和死亡诱骗受体3缺乏膜相互作用域，因此可作为可溶性蛋白分泌出胞外，其中 CD27、CD30、CD40分子，TNF-R1和TNF-R2等可溶性受体释放，Fas则通过选择性剪接编码跨膜区的外显子而产生，这些可溶性受体通过修饰释放后是机体肿瘤细胞实现免疫逃逸的重要方式［15，16］。近年来许多研究认为可溶性受体对其同源配体的激活作用中起着重要作用，Gileva等［17］在对TNFR类似物相关研究中发现，即正痘病毒的细胞因子反应修饰因子CrmB、CrmC和CrmD，这些病毒开放阅读框架编码受体与肿瘤坏死因子存在相互作用，并可能干扰炎性反应的发生。

4 肿瘤坏死因子受体家族结构特点

肿瘤坏死因子受体最具特征性结构是其胞外域富含半胱氨酸的结构域(cysteine-rich domains，CRDs)，通常载有6个半胱氨酸残基参与形成三个二硫键。CRDs的数量在不同的受体有所不同，从1到4个不等。人的CD30的三个CRDs有部分重复，但小鼠CD30没有。CRDs的重复和规则的排列在受体上形成一个拖长的形状，通过略有扭曲的二硫键而达到稳定。TNF-R的序列比对存在困难，因为受体间半胱氨酸残基的间隔并不总是固定的。多数研究认为TNF-R为单体，TNF-R1易形成头对头和头对尾的二聚体，组织中Fas、TNF-R1和CD40分子在细胞膜中易形成低聚物，低聚物结构的形成促使其插入外膜并形成通道，从而发挥生物学效应，而单体形成往往没有此功能［18］。

5 肿瘤坏死因子配体和受体的相互作用

1993年，Banner等［19］发表了开创性的研究来解释肿瘤坏死因子配体的一级结构与其同源受体(TNF-R1)的结合。其中三个受体与三个配体组装六组分的复合物，而单一的肿瘤坏死因子三聚体结合三个受体分子(图1)。最近，TRAIL和TRAIL-R2之间更多高度相似的晶体结构已被确认，其3∶3的比例是其基本的信号单位［12］。事实上，几何形状的受体-配体复合物促使TRAF-2和TNF-R2及CD40分子信号的传递。最近确定的受体 BCMA、TACI、BAFFR和成纤维细胞生长因子诱导的早期反应蛋白14参与TNF-R1及TRAIL-R2与其各自的配体的结合，这意味着不同的受体配体接口必须存在且三聚体的空间结构对于这些配体受体复合物可能也是保守的［20］。

受体分子的结合位于界面间单体与单体间形成的沟槽中，大致与三聚体中C3对称轴向平行。构象上的变化对复合体的形成影响相对较小，但很大程度上会影响受体与配体的接触(CD and AA')［19］。在受体和配体之间主要有两个接触区域，第一个区域涉及第二个CRD的相应残基(A1加一半的B2)，两个相邻配体亚基的DE和AA'(见图1)。这一区域载有相对保守的酪氨酸残基(见于 TNF、FasL、TRAIL等)，这在受体与配体TNF、FasL和TRAIL的结合中是至关重要的。第二个区域，即第二个CRD剩下的残基(另一半B2)，第三个CRD的A1(图1)是TNF-R1与相邻两个配体结合的区域。

图1 TNF受体与配体的相互作用

正如预期的那样，在家族成员之间，受体和配体的接触的位点是多种多样的，同时受体和配体的相互作用也是不尽相同的。不同的配体可以结合同一受体(如TNF和肿瘤坏死因子配体都可结合TNF-R1)，另外，同一个配体可以结合不同的受体。

6 小结

在过去的几年，越来越多的肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子受体家族成员被发现，这是基因工程结合生物信息学工具共同发展的一个直接后果。随着基因组计划的日趋完成，可以大胆地预测，这两个家族的全部成员将被揭开。它们都具有相对保守的分子结构和模式化相互作用。受体的克隆表达种类可能有意外的增加，因为它们的分子结构相比较其配体更加多样，而肿瘤坏死因子与其受体的分子特征提供了它们生物学作用的一个基础认识，这为它们与获得性或遗传相关疾病的相关性研究提供了物质基础［20］。

［1］ Zhao J，Chen H，Peschon JJ，et al．Pulmonary hypoplasia in mice lacking tumor necrosis factor-alpha converting enzyme indicates an indispensable role for cell surface protein shedding during embryonic lung branching morphogenesis［J］．Dev Biol，2001，232(1):204-218．

［2］ Komine M，Kukita A，Kukita T，et al．Tumor necrosis factor-alpha cooperates with receptor activator of nuclear factor kappaB ligand in generation of osteoclasts in stromal cell-depleted rat bone marrow cell culture［J］．Bone，2001，28(5):474-483．

［3］ Tagawa M，Kawamura K，Shimozato O，et al．Virology-and immunology-based gene therapy for cancer［J］．Cancer Immunol Immunother，2006，55(11):1420-1425．

［4］ Wi'sniewski SA，Kobielak A，Trzeciak WH，et al．Recent advances in understanding of the molecular basis of anhidrotic ectodermal dysplasia:discovery of a ligand，ectodysplasin A and its two receptors［J］．J Appl Genet，2002，43(1):97-107．

［5］ Ng LG，Mackay CR，Mackay F．The BAFF/APRIL system:life beyond B lymphocytes［J］．Mol Immunol，2005，42(7):763-772．

［6］ Xue C，Lan-Lan W，Bei C，et al．Abnormal Fas/FasL and caspase-3-mediated apoptotic signaling pathways of T lymphocyte subset in patients with systemic lupus erythematosus［J］．Cell Immunol，2006，239(2):121-128．

［7］ Zhang L，Fang B．Mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in cancer［J］．Cancer Gene Ther，2005，12(3):228-237．

［8］ Zhang G．Tumor necrosis factor family ligand-receptor binding［J］．Curr Opin Struct Biol，2004，14(2):154-160．

［9］ Zhang M，Ko KH，Lam QL，et al．Expression and function of TNF family member B cell-activating factor in the development of autoimmune arthritis［J］．Int Immunol，2005，17(8):1081-1092．

［10］ Debatin KM，Krammer PH．Death receptors in chemotherapy and cancer［J］．Oncogene，2004，23(16):2950-2966．

［11］ Locksley RM，Killeen N，Lenardo MJ．The TNF and TNF receptor superfamilies:integrating mammalian biology［J］．Cell，2001，104(4):487-501．

［12］ Cha SS，Song YL，Oh BH．Specificity of molecular recognition learned from the crystal structures of TRAIL and the TRAIL:sDR5 complex［J］．Vitam Horm，2004，67(1):1-17．

［13］ Song C，Jin B．TRAIL(CD253)，a new member of the TNF superfamily［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2005，19(1):73-77．

［14］ Hao C，Song JH，Hsi B，et al．TRAIL inhibits tumor growth but is nontoxic to human hepatocytes in chimeric mice［J］．Cancer Res，2004，64(23):8502-8506．

［15］ Scapini P，Bazzoni F，Cassatella MA．Regulation of B-cell-activating factor(BAFF)/B lymphocyte stimulator(BLyS)expression in human neutrophils［J］．Immunol Lett，2008，116(1):1-6．

［16］ Takahashi Y，Tanaka R，Yamamoto N，et al．Enhancement of OX40-induced apoptosis by TNF coactivation in OX40-expressing T cell lines in vitro leading to decreased targets for HIV type 1 production［J］．AIDS Res Hum Retroviruses，2008，24(3):423-435．

［17］ Gileva IP，Nepomnyashchikh TS，Antonets DV，et al．Properties of the recombinant TNF-binding proteins from variola，monkeypox，and cowpox viruses are different［J］．Biochim Biophys Acta，2006，1764(11):1710-1718．

［18］ Holler N，Tardivel A，Kovacsovics-Bankowski M，et al．Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex［J］．Mol Cell Biol，2003，23(4):1428-1440．

［19］ Banner DW，D'Arcy A，Janes W，et al．Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex:implications for TNF receptor activation［J］．Cell，1993，73(3):431-445．

［20］ Sieper J．Spondyloarthropathies in 2010:new insights into therapy-TNF blockade and beyond［J］．Nat Rev Rheumatol，2011，7(2):78-80．