香附不同炮制品HPLC指纹图谱研究

徐 媛 ，张文娟 ，王庆伟 ，刘新友 ，程 敏

1.第四军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安 710038；2.陕西商洛学院生物医药工程系，陕西 商洛 726000

香附来源于莎草科植物莎草（Cyperus Rotundus L.）的干燥根茎，性辛，味微苦、微甘，性平，归肝、脾、三焦经，是临床常用中药，具有疏肝理气、调经止痛之功效[1]。其炮制方法多样，用途极其广泛。笔者采用指纹图谱研究的方法，对香附及经不同方法（醋炙、酒炙、炒炭）炮制后的香附炮制品的化学成分变化作了初步研究，发现香附经不同方法炮制后，化学成分存在很大差异。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（岛津SPD-10AvP）；超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂）；电子分析天平（BS 223S赛多利斯）；粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司，型号：FW200）；电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：98-1-B）。

甲醇（天津市红岩化学试剂厂，分析纯）；流动相所用甲醇为色谱纯（美国FISHER公司）；水为纯化水；α-香附酮对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110748-201010，含量测定用）；香附药材（购于西安中药饮片厂，产地陕西产关中，经第四军医大学药学院生药教研室王四旺教授鉴定为莎草科植物莎草的根茎，批号：20100501）。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS-2（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（0～5 min，甲醇比例为 10%～50%；6～50 min，甲醇比例为51%～100%），二元梯度洗脱；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；记录时间：60 min。

2.1.2 对照品溶液制备

精密称取α-香附酮对照品适量，用甲醇制成0.02 mg/ml的溶液。

2.1.2 供试品溶液制备

取待测样品30 g，加甲醇80 ml，超声提取30 min，放至室温后甲醇定容至100 ml，摇匀，静置后滤过，取续滤液即得。

2.1.3 检测法

分别吸取上述对照品溶液、供试品溶液各10 μl注入高效液相色谱仪。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、6、12、24 h进样，测定色谱图，对主要峰峰面积进行比较，结果各时间点测定色谱图保留时间稳定，主要峰峰面积相对RSD为1.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.4.2 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，测定色谱图，对主要峰峰面积进行比较，结果6次测定色谱图保留时间稳定，主要峰峰面积相对RSD为0.72%，精密度良好，符合规定。

2.1.4.3 重现性试验 取同一批次香附药材 （生香附），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6份，连续进样6次，测定色谱图，对主要峰峰面积进行比较，结果6次测定色谱图保留时间稳定，主要峰峰面积相对RSD为0.72%，重现性良好，符合规定。

2.2 指纹图谱测定

2.2.1 香附不同炮制品的制备

根据《中药炮制学》[2]对香附进行不同方法的炮制。

2.2.1.1 生香附 取原药材100 g，除去毛须及杂质，碾成绿豆大颗粒，浸透或切薄片，干燥，筛去碎屑备用。

2.2.1.2 醋香附（醋炒）取净香附饮片100 g，加20 g米醋拌匀，闷润至醋被吸尽，置炒制容器内，用文火加热炒干，取出晾凉备用。

2.2.1.3 酒香附 取净香附饮片100 g，加入20 g黄酒拌匀，闷润至黄酒被吸尽，置炒制容器内，用文火加热炒干，取出晾凉，筛去碎屑备用。

2.2.1.4 香附炭 取净香附饮片100 g，置炒制容器内，用中火加热，炒至表面焦黑色，内部焦褐色，喷淋清水少许，灭尽火星，取出晾干，凉透，筛去碎屑备用。

2.2.2 香附及不同炮制品指纹图谱研究

分别取香附及不同炮制品依照“2.1.2”制备供试品，于上述色谱条件下进样记录指纹图谱。

2.3 结果

2.3.1 对照品、生香附及炮制品提取液色谱图

对照品、生香附及炮制品提取液色谱图，见图1。

图1 香附指纹图谱

2.3.2 不同炮制品甲醇提取物主要色谱峰保留时间及峰面积

不同炮制品甲醇提取物主要色谱峰保留时间及峰面积，见表1。

结果显示，16号峰为α-香附酮的色谱峰，作为基准峰。1号峰的峰面积变化明显，醋香附＞酒香附、香附炭＞生香附，各炮制品峰面积均远大于生香附，而醋香附的峰面积明显大于其他炮制品；2号峰的峰面积，香附炭＞酒香附＞醋香附＞生香附，各炮制品峰面积差异均显著；3号峰的峰面积，香附炭＞醋香附＞酒香附＞生香附，香附炭峰面积远大于其他各炮制品；4、5、8、9、10、13、14、16、17 号峰中香附炭远小于其他炮制品，生香附、醋香附、酒香附的峰面积变化不大；6号峰生香附、醋香附、酒香附变化不大，香附炭在该保留时间无峰；7号峰的峰面积，生香附＞酒香附＞香附炭＞醋香附，醋香附、香附炭峰面积显著小于生香附、酒香附，生香附、酒香附变化不大；18号峰的峰面积，生香附＞醋香附＞酒香附＞香附炭，各炮制品峰面积变化明显；19号峰仅生香附、香附炭有峰，且生香附峰面积，远大于香附炭，而酒香附、醋香附均无峰；20、21号峰的峰面积，酒香附＞醋香附＞生香附＞香附炭，生香附、醋香附峰面积差异不大，而酒香附远大于其他炮制品，香附炭峰面积远小于其他炮制品；11、12、15号峰无明显差异。

3 讨论

实验过程中对不同流动相及柱温进行了考察，结果显示，柱温在30℃时，以甲醇-水为流动相梯度洗脱能使样品中各成分的色谱峰较好分离，60 min后无色谱峰出现。

表1 香附炮制品甲醇提取物主要峰的保留时间及峰面积

对香附不同炮制品指纹图谱进行比较，结果显示不同炮制品之间成分差异显著，主要表现在30 min后主要峰的减少与30 min前主要峰的增加，即脂溶性成分的减少与水溶性成分的增加，与传统中药炮制理论相一致。

中药成分复杂，将指纹图谱研究应用于中药炮制的研究与单一成分研究相比，更能真实地反映炮制对中药成分的影响，如能结合成分结构鉴定，将能得到更详尽的数据，对炮制引起的中药成分变化做出更深入的描述。

历代本草及中医药专著中记载香附的炮制品种繁多，唐代有炒制法；宋代有蒸制、煮制、酒制、米泔浸后蒜仁制、石灰制、胆汁制、童便粗盐水制、炭制等；元代有醋煮制、童便制、麸炒制；到了明、清时代，除沿用元代以前的炮制方法外，最突出的是在辅料制方面增加较多，如有酒、醋、姜、童便的“四制香附”、“五制香附”、“六制香附”、“七制香附”等炮制方法[2]。《本经逢原》[3]记载：“入血分补虚童便浸炒；调气盐水浸炒；行经络酒浸炒；消积聚醋浸炒；气血不调，胸膈不利，则四者兼制；肥盛多痰，姜汁浸炒；止崩漏血，童便制炒黑；走表药中则生用之”。《本草纲目》[4]也对其有“生则上行胸膈，外达皮肤；熟则下走肝肾，外彻腰足。炒黑则止血，得童溲浸炒则入血分而补虚，盐水浸炒则入血分而润燥……酒浸炒则行经络，醋浸炒则消积聚，姜汁炒则化痰饮。”的记载，被誉为“血中之气药”、“气病之总司，女科之主帅”。本文主要对现代临床常用的生香附、醋香附、酒香附和香附炭4种炮制品的指纹图谱进行了分析。

香附主要含有挥发油类成分，其所含挥发油类成分为0.65%～1.40%，迄今已从其挥发油中分离出了140多种成分，包括单萜、倍半萜及其氧化物，多数已确定其结构式，主要为α-香附酮、α-香附烯 （含量之和约占挥发油的28.85%）[5-7]。此外，香附还有糖类、生物碱类、苷类、黄酮类、酚类和三萜类化合物[8-9]，但相关结构鉴定报道尚少。本文采用指纹图谱对香附不同炮制品进行初步分析，为具体成分的分离鉴定奠定了基础。

[1]江苏医科大学.中药大辞典[M].上海:上海人民出版社,1977:672.

[2]龚千锋.中药炮制学[M].北京:中国中医药出版社,2006:202-203.

[3]张璐.本经逢原[M].北京:中国中医药出版社,1996:7.

[4]李时珍.本草纲目[M].重庆:重庆出版社,2006:7.

[5]田友清,丁平.香附挥发油的研究进展及其开发前景[J].中国药业,2010,19(3):1-2.

[6]LIN XS,WU HQ,HUANG F.Analysis of Essential Oils from Cyperus rotundus by GC/MS [J].Journal of Chinese Mass Spectrometry Societ,2006,27(1):40-44.

[7]Feng YF,Guo XL,Meng Q,et al.Study on the chemical substrates of SFE extract from Rhizoma Cyperi [J].Journal of Chinese medicinal materials,2006,29(3):232-235.

[8]黄锁义,罗建华,张丽丹.香附总黄酮的超声波提取工艺研究[J].时珍国医国药,2008,19(1):141-142.

[9]XU Y,ZHANG Z Z,ZOU Z M.Studies on Chemical Constituents of the Rhizomes of Cyperus rotundus L[J].China Pharm,2010,45(11):818-821.