HIF-1α在进展性肾炎大鼠肾小管间质中的表达及ARB的干预作用

査 艳，胡 英，沈 燕，黄朝晖，俞 雷

(1贵州省人民医院，贵阳550004;2贵州省电力医院)

肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病致肾衰竭的主要病理改变和共同通路。“慢性低氧学说”是目前肾脏病学界的研究热点，其认为肾小管间质细胞的慢性氧缺失是促进肾脏纤维化的重要原因［1］。目前氯沙坦除用于降压外，还用于临床延缓肾功能不全进展的治疗，但其对肾脏保护作用的具体机制尚不完全清楚。2008年10月～2010年10月，我们检测了低氧诱导因子(HIF-1α)在进展性肾炎大鼠肾小管间质中的表达及氯沙坦的干预作用，旨在探讨氯沙坦在慢性低氧状态下对肾小管间质的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠(重庆腾鑫生物技术公司提供，二级)25只，体质量(126.7±10)g。氯沙坦购自杭州默沙东制药公司，小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购于美国Neo Markers公司，小鼠抗人HSP47单克隆抗体购于加拿大Assay Designs Stressgen公司。总RNA提取Trizol试剂购于美国 Gibco-BRL公司，辣根过氧化物酶标记抗兔二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。全自动多功能生化分析仪(日本Hitachi公司);SN-628放射免疫γ计数仪(中国科学院上海原子核研究所);光学显微镜(日本O-lympus公司)。

1.2 造模及干预 将25只大鼠随机分为假手术组、模型组、未给药组、小剂量组、大剂量组各5只，假手术组只做肾包膜剥离，不做肾脏切除;后四组均参照文献［2］制作进展性肾炎致肾小管间质纤维化模型，行右肾摘除术;术后第1、2周于鼠尾静脉注射IgG(OX-7)标记小鼠单克隆抗Thy1.1抗体1.2 mg/kg 2次;2周后未给药组、小剂量组、大剂量组则分别予氯沙坦0、20、80 mg/(kg·d)入饮水中灌胃至8周，除模型组于4周时麻醉下处死大鼠外，余组均8周时处死，收集24 h尿液，取大鼠心脏血并制作肾组织标本。

1.3 相关指标检测 ①收缩压(SBP)。采用普升科技有限公司鼠尾无创血压测量仪LE5001测鼠尾SBP。②24 h尿蛋白定量。应用双缩脲法测定。③血肌酐(SCr)。采用日本Hitachi公司全自动生化分析仪用化学法测定。④肾组织病理改变及肾间质面积。5%中性甲醛固定肾组织，常规HE、PAS、PAM、MASSON染色，显微镜下观察肾脏病理改变。200倍光镜下每个标本选取选10个肾小管间质视野(避开肾小球和大血管)，每个视野分别测量肾间质面积与统计场面积的比值。采用显微图象分析系统(Olympus C3040-ADU)对各组染色结果进行积分光密度(IOD)测定，每张切片随机选取10个高倍视野(200倍)，每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD值，取平均值。⑤HIF-1α、热休克蛋白47(HSP47)mRNA表达测定。采用原位杂交法。取3 μm厚石蜡切片，常规脱蜡至水，灭活内原性酶，热修复抗原，抗原抗体反应，DAB显色、脱水、透明、封片、显微镜观察。HIF-1α、HSP47mRNA原位杂交所用探针为经地高辛标记的针对HIF-1α、HSP47基因的多相寡核苷酸探针，操作步骤按试剂盒说明书进行。阳性产物呈深紫色，不加探针为阴性对照。HIF-1α、HSP47 mRNA表达以IOD值表示，数量级为×103。⑥相关性分析。对肾小管间质中HIF-1α、HSP47 mRNA表达行Pearson相关性分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件，计量数据用±s表示，组间比较行t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

各组相关指标检测结果见表1。PAS染色示假手术组肾小管间质形态基本正常，模型组见肾小管上皮细胞萎缩、部分肾小管扩张、间质水肿，炎症细胞浸润并出现纤维化;未给药组大部分肾小管上皮细胞脱落，管腔扩张，管型堵塞，间质炎症和纤维化进行性加重。小剂量组肾小管间质损伤得到改善;大剂量组肾小管间质损伤得到显著修复。HIF-1α mRNA表达主要集中于肾小管上皮细胞的胞质，HSP47 mRNA表达主要集中于肾小管上皮细胞和间质细胞的胞质。相关分析示HIF-1α与HSP47 mRNA 表达呈正相关(r=0.794，P ＜0.01)。

3 讨论

表1 各组相关指标检测结果(n=5，±s)

表1 各组相关指标检测结果(n=5，±s)

注:与假手术组比较，◆P ＜0.01;与未给药组比较，△P ＜0.01;与模型组比较，*P ＜0.01，★P ＜0.05;与小剂量组比较，▲P ＜0.01，◇P ＜0.05

mRNA HSP47 mRNA模型组 135±6◆ 101.22± 9.67◆ 156.54± 9.86◆ 0.18±0.03◆ 28.53±4.08◆ 44.52±4.27组别 SBP(mmHg) SCr(μmol/L) 尿蛋白(mg/d) 肾间质面积 HIF-1α◆0.34 1.76 ±0.23未给药组 148±5 163.04±13.45◆ 297.32±26.29◆ 0.26 ±0.05◆ 46.32 ±6.34◆ 53.92±5.01◆低剂量组 127±4 79.15± 3.93△★ 109.42± 7.49 0.13 ±0.02△ 20.28 ±2.73△ 26.49±3.06△大剂量组 101±5△★ 64.73± 4.92△＊ 53.21± 6.05△＊◇ 0.10 ±0.01△＊ 9.46 ±2.25△＊▲ 11.05±2.46△＊▲假手术组 112 ±3 56.35 ± 3.78 21.26 ± 3.07 0.08 ±0.01 2.36 ±

研究发现，慢性缺氧是导致肾小管间质纤维化的主要因素之一［3］。低氧刺激产生的许多蛋白分子与肾纤维化密切相关，如低氧可使人近曲小管上皮细胞、人肾脏成纤维细胞TGF-βmRNA表达增加［4］，促进细胞外基质合成、抑制细胞外基质降解［5］。HIF-1属于转录因子，是由 α/β 两个亚基形成的异源二聚体。HIF-1α在体内特异地受氧浓度调节，当体内氧浓度下降时，HIF-1α迅速在细胞内积聚使细胞内水平增加;当恢复正常氧浓度时，HIF-1α蛋白很快被泛素降解;而HIF-1α对低氧不敏感，故HIF-1α蛋白可作为低氧的指标［6］。肾小管间质纤维化的重要特征是肾间质胶原蛋白合成和沉积增加。HSP47是一种胶原特异性的“分子伴侣”，在胶原生物合成过程中协助前胶原修饰、折叠、装配，其表达增加与间质过度积聚胶原有密切关系［7～9］。但慢性低氧在进展性肾炎中能否诱导肾小管间质细胞HSP47表达尚未见文献报道。

进展性肾炎大鼠［2］是目前观察慢性肾脏病进展较理想的动物模型，该模型于4～11周小管间质的有效循环血流量下降近40%，出现持续的肾小管间质缺血缺氧，有利于观察低氧状态对肾脏的损害。本研究结果显示，模型组SBP、SCr、24 h尿蛋白均明显高于假手术组，术后肾小管灶状萎缩，出现间质纤维化，表现出与人类肾脏纤维化一致的病理过程，与 Matsumoto［2］研究结果一致。

氯沙坦为血管紧张素受体拮抗剂(ARB)，可竞争性抑制AngⅡ与其受体结合，且主要与AT1结合，阻断AngⅡ引起的血管收缩、交感兴奋、醛固酮分泌增多等作用，因而可以缓解肾损伤［10］。本研究发现，通过应用不同剂量的氯沙坦治疗4周后，SCr、24 h尿蛋白均较模型组明显减少，但大剂量组SBP与假手术组比较无显著差异，说明在保证血流动力学稳定情况下，大剂量氯沙坦可明显减少尿蛋白，改善肾功能。

已有研究表明，进展性肾炎大鼠肾脏组织中存在小管间质持续性的炎症和缺血、缺氧。本研究结果显示，模型组及未给药组HIF-1α均明显高于假手术组，说明在发生小管间质纤维化前肾小管存在明显缺氧，与Manotham等［11］报道一致。目前虽无研究证实HIF-1α可直接通过调节HSP47表达，参与肾脏胶原合成增加致肾纤维化。但Kimura等［12］通过制作 pVHL-/-基因敲除小鼠发现 60周龄的pVHL-/-小鼠肾间质纤维化面积明显增加，注射HIF-1α拮抗剂YC-1后可抑制pVHL-/-小鼠肾纤维化的进展。因此认为抑制HIF-1α表达是治疗肾脏纤维化的新靶点。已有研究结果证实，氯沙坦能通过减少转化生长因子β1的表达来减轻肾脏纤维化［13］。本研究结果显示，经氯沙坦治疗4周后，进展性肾炎大鼠肾小管间质纤维化显著改善，HIF-1α及HSP47表达降低，可见在保证血流动力学稳定情况下，大剂量氯沙坦不但能抑制，而且还可一定程度逆转肾小管间质的纤维化进展。

综上所述，氯沙坦可能通过干预进展性肾炎大鼠HIF-1α表达而发挥肾脏保护作用。

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