兔膝关节ACL损伤后韧带内本体感受器的变化及机制

李 彬，吴海山，温 昱

(1中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004;2上海长征医院;3中国医科大学组胚教研室)

前交叉韧带(ACL)不仅是膝关节的被动稳定装置，对于膝关节正常本体感觉维持亦起重要作用［1，2］。ACL损伤后力学强度下降，但残存韧带结构仍连接着股骨和胫骨，从而使韧带内保留的本体感受器可继续受到机械刺激，这种状况下ACL是否可以发挥本体感觉功能及其随时间的变化少见报道。2008年6～12月，我们观察了不同时间段ACL损伤后残存韧带内本体感受器形态和功能变化，并探讨其可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康新西兰大白兔12只，雌雄不限，体质量1 500～2 000 g。氯化金、88%甲酸、100%甘油、石蜡螺旋切片机、数码照相机(COOLPIX 4500)、日本光电MEB-2200诱发电位仪。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 12只兔均取一侧膝关节制备ACL损伤模型(模型组):3%戊巴比妥钠耳缘静脉给药麻醉，采用膝关节髌旁内侧入路切开，显露前交叉韧带，将韧带切断3/4，只余1/4连接，逐层间断缝合切口，敷料包扎。另一侧不做手术作为正常侧(对照组)。术毕单只笼内喂养。切口换药前后均肌注青霉素10万U预防感染，术后2、4、6个月分别取4只兔行电生理学检查，之后分别采用耳缘静脉推注空气栓塞法处死实验动物，进行本体感受器观察。

1.2.2 电生理学指标检测 将家兔用乙醚吸入麻醉结合1%利多卡因局部麻醉，麻醉成功后固定头部及四肢，采用膝关节内侧髌旁入路切开并显露ACL。两眶后缘连线与正中矢状线交点后0.5 cm并旁开0.2 cm作为记录电极点，皮层参考电极放置于鼻根部皮下，后肢近端用皮下电极接地测定体感诱发电位(SEPs)。而后将记录电极置于腘绳肌肌腹，参考电极放置于内踝部行肌电图(EMG)检查。用双极表面电极刺激前交叉韧带偏两极骨附着部位，刺激强度18～20 V。采用日本光电MEB-2200诱发电位仪记录SEPs和EMG，信号输入微机操作系统，分析SEPs和EMG图形、潜伏期和波幅。

1.2.3 本体感受器结构及数量观察 实验动物处死后将ACL的股骨和胫骨附着点切断后完整取出，采用改良氯化金染色方法进行染色［3］，具体过程:置于新鲜柠檬汁和88%甲酸的混合液中(柠檬汁∶88%甲酸=3∶1)，而后暗室中室温下放置15min;取出标本，用滤纸吸干表面残余液体，将其放入1%氯化金溶液中，于暗室中室温放置30 min;取出标本，用滤纸吸干表面残余氯化金溶液，放入25%甲酸溶液，暗室中室温下放置15 h。蒸馏水冲洗标本至少1 h后放入纯甘油中保存24 h以上;常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，制成15μm厚切片，光学显微镜观察。每个ACL标本石蜡块固定于螺旋切片机上进行连续切片，石蜡切片条带按顺序摆放，分清韧带的股骨附着端、中间部和胫骨附着端，利用本体感受器周围韧带组织的特征性结构进行分辨，计数本体感受器。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件。计量资料用±s表示，组间比较采用方差检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电生理学指标 见表1。

表1 两组SEPs及EMG潜伏期和波幅变化(±s)

表1 两组SEPs及EMG潜伏期和波幅变化(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

检测指标 模型组2个月 4个月 6个月 对照组SEPs潜伏期(ms)17.6 ±7.9 20.3 ±9.4 22.4 ±10.1 14.3 ±4.7*波幅(μV) 11.4 ±6.3 6.6 ±2.1 5.9 ± 1.9 21.0 ±4.9*EMG潜伏期(ms)12.0 ±3.8 15.0 ±6.7 16.0 ± 7.1 6.1 ±1.2*波幅(mV) 0.3 ±0.04 0.2 ±0.03 0.2 ± 0.01 0.5 ±0.08*

2.2 本体感受器结构及数量 光学显微镜下对照组可观察到4种类型神经末梢:Ruffini小体、Pacinian小体、Golgi类健体和游离神经末梢。Ruffini小体呈树状外观，具有主干、枝干和叶状结构;Pacinian小体呈椭圆形和圆筒状外观，外周是一层厚板层状的背囊;Golgi类腱体体积最大，呈螺旋状外观;游离的神经末梢是无髓神经纤维，形状无一定规律。其中游离神经末梢和Ruffini小体数量最多。所有的神经末梢结构主要分布于韧带的骨端(主要是股骨端)附着点附近。观察组损伤后2、4、6个月韧带内典型结构的感受器逐渐减少，非典型的感受器结构数量增多，其中Ruffini小体体积减小，树状结构中的叶状结构减少，Pacinian小体体积减小，被囊变薄甚至有部分的缺损，总的神经感受器结构(包括典型和非典型)数量明显减少。

3 讨论

以往多数学者认为韧带只是被动发挥稳定关节的作用，随着研究的深入，逐渐认识到韧带内本体感受器对于维持关节的正常功能必不可少。1944年Gardner［4］在猫膝关节内侧副韧带中发现了神经纤维结构，但未对ACL进行此类研究。Schultz等［5］在1984年对人体ACL采用氯化金染色方法观察并描述了神经末梢的结构，此后关于ACL的生物力学和神经生理特性的研究广泛开展。Freeman等［6］改良氯化金染色方法后对人体ACL进行观察并记录了四种神经末梢结构:Ruffini小体、Pacinian小体、Golgi类腱体和游离神经纤维，在此基础上其特别提出ACL承担的神经生理方面功能与其生物力学作用同样重要。随后越来越多的研究证实，ACL的本体感觉功能与膝关节的功能密切相关，ACL损伤后不但导致膝关节不稳，其承担的本体感觉作用削弱亦是膝关节功能下降的重要原因［1，2］。关节内韧带本体感受器的结构及功能对判定关节功能及是否保留感受器至关重要。

ACL严重损伤患者需要手术治疗进行重建以恢复膝关节的稳定是目前关节外科的共识，但对于部分损伤仅存在操作检查轻度异常而无明显症状和体征患者的治疗，存在两种不同治疗意见:传统的治疗方法证实通过合适的保守治疗措施可使膝关节基本功能恢复;而近年来多数学者认为，ACL损伤必然会削弱膝关节的稳定性，这种客观的关节不稳将导致关节的提前退变，因而建议对ACL损伤重建持积极态度。临床研究证实康复治疗不但有助于提高膝关节的稳定性，而且可明显改善本体感觉状态［1，2］。对损伤ACL本体感觉作用的研究有助于更科学地指导损伤膝关节的康复治疗，对行ACL重建的患者亦可明确残存韧带的去留问题。Adachi等［7］对ACL损伤的患者进行关节镜操作时病检残存的ACL组织，发现术前患膝位置觉测定结果与术中发现的残存组织的机械受体数量明显相关，说明ACL在膝关节的本体感觉中起重要作用，但其未说明这些韧带损伤的时间，亦未提供残存的ACL内本体感受器形态变化。

对人体膝关节本体感觉的测试方法很多，但用于实验动物的方法较少，SEPs和EMG是目前公认可以用于检查实验动物膝关节本体感觉状态的方法［8，9］，尤其腘绳肌收缩潜伏期在 ACL损伤后常显著延长，与膝关节的功能性不稳直接相关，可作为ACL受损后本体感觉的客观指标。本研究结果显示，观察组随损伤时间延长SEPs和EMG的潜伏期逐渐增加，波幅逐渐降低，说明损伤韧带内神经纤维在维护膝关节正常本体感觉方面的作用逐渐减弱。观察组随损伤时间延长韧带内神经纤维数量逐渐减少，本体感受器的形态发生改变，异形的本体感受器增多，体积缩小，部分结构缺失。说明ACL损伤后韧带内的本体感受器短期内仍能发挥一定作用，但随损伤时间延长，其作用逐渐减弱。机制可能与韧带损伤后强度下降，逐渐松弛，从而使韧带内神经结构在膝关节活动的过程中不能受到应有的力学刺激有关。

［1］Fremerey RW，Lobenhoffer P，Zeichen J，etal.Proprioception after rehabilitation and reconstruction in kneeswith deficiency of the anterior cruciate ligament:a prospective，longitudinal study［J］.JBone Joint Surg(Br)，2000，82(6):801-806.

［2］Fremerey RW，Lobenhoffer P，Born I，etal.Can knee joint proprioception by reconstruction of the anterior cruciate ligament be restored?A prospective longitudinal study［J］.Unfallchirurg，1998，101(9):697-703.

［3］Zimny ML，St Onge M，Schutte M.Amodified gold chloridemethod for the demonstration of nerve endings in frozen sections［J］.Stain Technol，1985，60(5):305-306.

［4］Gardner E.The distribution and termination of nerves in the knee joint of the cat［J］.JComp Neurol，1944，80(1):11-32.

［5］Schultz RA，Miller DC，Kerr CS，etal.Mechanoreceptors in human cruciate ligaments.A histological study［J］.J Bone Joint Surg，1984，66(7):1072-1076.

［6］Freeman MAR，Wyke BD.The innervation of the knee joint.An anatomical and histological study in the cat［J］.JAnat，1967，101(Pt3):505-532.

［7］Adachi N，OchiM，Uchio Y，etal.Mechanoreceptors in the anterior cruciate ligament contribute to the joint position sense［J］.Acta Orthop Scand，2002，73(3):330-334.

［8］Ochi M，Iwasa J，Uchio Y，et al.The regeneration of sensory neurons in the reconstruction of the anterior cruciate ligament［J］.J Bone Joint Surg(Br)，1999，81(5):902-906.

［9］Beard DJ，Kyberd PJ，Fergusson CM，et al.Proprioception after rupture of the anterior cruciate ligament:an objuctive indication of the need for surgery［J］.J Bone Joint Surg(Br)，1993，75(2):311-315.