HIF-1α和STAT3分子表达与大肠癌淋巴转移的关系*

朱凤池 戚 峰 巩发才 季 兵 刘 彤

区域性淋巴转移是大肠癌最常见的转移途径，伴有淋巴结转移的大肠癌患者5年生存率远低于无淋巴结转移者[1]。多种因素影响大肠癌淋巴结转移过程，其中血管内皮生长因子（VEGF）-C具有重要作用，低氧诱导因子（HIF-1）、信号转导和转录活化因子（STAT3）可作为启动子的主要转录因子诱导VEGF。本研究旨在探讨HIF-1α和STAT3在大肠癌淋巴转移中的作用，为寻找新的大肠癌分子靶点提供理论参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集我院2008年4月—2009年3月经病理证实为大肠癌的标本60例，男32例，女28例，年龄43～80岁，平均年龄（67±2）岁，术前均未进行任何治疗。腺癌52例，黏液腺癌8例；高分化15例，中分化33例，低分化12例。浸润深度：T1+T2 4例，T3 47例，T4 9例；淋巴结转移31例；Dukes分期：A+B期29例，C期22例，D期9例。每例标本均采集大肠癌组织（T组）和远癌切端肠组织黏膜（N组），采集标本分别于-80℃冷冻保存和浸泡于10%福尔马林备用。

1.2 方法

1.2.1 目标基因mRNA水平检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测HIF-1α、STAT3和VEGF-C的基因转录，包括提取细胞总RNA并纯化，合成cDNA第一链，利用PCR方法扩增模板cDNA，回收DNA片段制作标准曲线。根据标准曲线标本中各自的拷贝数，用GAPDH作为内参对HIF-1α、STAT3和VEGF-C进行校正。每个样本标本均重复测量3次，取其平均值。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.2 目标基因蛋白表达水平检测 取标本石蜡切片常规脱蜡水化后，于pH 6.0枸橼酸盐缓冲液中微波加热作抗原修复，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，进行免疫组化检测。采用免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（SABC法）分别检测HIF-1α、STAT3和VEGF-C的蛋白表达水平，一抗分别为兔抗人的HIF-1α、STAT3及VEGF-C多克隆抗体。

1.2.3 免疫组化结果判断 HIF-1α和VEGF-C结果参考Zhong等[2]的方法，HIF-1α阳性细胞数<1%为阴性，阳性细胞数≥1%为阳性。VEGF-C阳性细胞数<25%为阴性，阳性细胞数≥25%定为阳性。STAT3结果判定参照Saito等[3]综合计分法，0～2分为阴性，≥3分为阳性。

1.2.4 淋巴管密度（LVD）计算 以小鼠抗人podoplanin单克隆抗体标记大肠癌微淋巴管，检测微淋巴管密度。按照Wei⁃dner等[4]报道的方法，先在低倍镜（×40）下扫视整个视野的肿瘤区域，选择其中的4个淋巴管密集区，然后在高倍镜（×200）下计数微淋巴管数，取其平均值作为该例标本的LVD值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件包进行数据分析处理，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用卡方检验，相关性采用Spearman秩相关检验和R×C表分类资料的关联性分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 HIF-1α、STAT3和VEGF-C表达与远癌切端及淋巴结转移的比较 T组中HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子的mRNA转录水平及蛋白表达阳性比例高于N组，淋巴结转移患者HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子表达高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图1。

表2 HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子表达与远癌切端及淋巴结转移的关系

2.2HIF-1α、STAT3与VEGF-C的mRNA表达相关性 HIF-1α和STAT3与VEGF-C mRNA转录水平均呈正相关（rs分别为0.873和0.982，均P<0.05）。

2.3 HIF-1α、STAT3与VEGF-C的蛋白表达相关性 HIF-1α和STAT3阳性组的VEGF-C表达明显高于阴性组的表达，呈正相关（均P<0.05），见表3。

表3 HIF-1α、STAT3与VEGF-C蛋白表达水平的关系

2.4 有无淋巴结转移患者LVD比较 淋巴结转移患者LVD为19.81±7.36，高于无淋巴结转移患者的15.49±5.76，差异有统计学意义（t=2.521，P<0.05）。

3 讨论

淋巴结转移是大肠癌常见的转移途径，本实验研究了在大肠癌淋巴结转移中起重要作用的HIF-1α、STAT3和VEGF-C分子。Royston等[5]认为，VEGF-C的过度表达增加了肿瘤内及肿瘤边缘淋巴管的表面积，利于癌细胞转移。随着原发肿物的发展，淋巴管截面平均面积增多，促使癌细胞更容易进入淋巴管而转移，提示淋巴管新生在大肠癌转移起重要作用。因此，VEGF-C在大肠癌癌变过程中起一定的促进作用。

淋巴管生成可发生在炎症、肿瘤等的病理过程。Gao等[6]研究发现，淋巴管生成是主动介导肿瘤转移的。肿瘤早期常发生淋巴结转移，提示淋巴管在肿瘤转移过程中起重要作用。本研究显示，大肠癌组织淋巴结阳性标本中LVD明显升高，提示微淋巴管生成与大肠癌淋巴结转移密切相关。

HIF-1α是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物及人体的一种转录因子。恶性肿瘤生长过程，由于组织增生过快造成局部严重缺氧和供能与耗能之间不平衡。HIF-1α能通过诱导VEGF-C和糖酵解相关酶的表达，增加供血、供能，表明HIF-1α与肿瘤发生发展密切相关。本研究亦显示，HIF-1α与VEGF-C的表达存在正相关性，提示肿瘤迅速增殖引起组织缺血缺氧，诱导HIF-1α的表达，促进肿瘤淋巴管的生成。

STAT3是EGFR、IL26/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点，在多种肿瘤细胞中均发现持续性过度激活。STAT3的表达可以调控该转录因子参与的多种异常的肿瘤信号途径：如抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2，细胞周期控制基因C-fos等的表达，从而诱导肿瘤细胞增殖，阻断细胞凋亡[7]。因此，STAT3基因被公认为是重要的癌基因之一。Niu等[8]研究发现STAT3可以直接结合VEGF基因的启动子，从而调控VEGF的表达。本研究发现，STAT3与VEGF-C的表达存在相关性。因此，阻断STAT3信号通路可以阻断有多种信号途径介导的肿瘤淋巴管生成，阻止肿瘤的生长和转移。STAT3是一个抑制肿瘤VEGF表达和淋巴管生成的有效靶点。

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