男性高尿酸血症患者血浆代谢组学的研究*

钟 麒 高玉霞 常 红 王 璇 张美琳 边姗姗 黄国伟

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是以体内嘌呤代谢紊乱、尿酸增高为特征的疾病。目前其在中老年男性中的发病率逐年升高[1]。HUA可诱发痛风、尿石症等疾病,且血尿酸水平升高与代谢综合征（metabolic syndrome，MS）密切相关[2]。代谢组学对于了解疾病状态时代谢谱的改变及改变的机制，寻找与疾病进展有关的代谢或代谢产物及其导致疾病进展的机制有重要价值[3]。本研究通过对HUA患者血浆代谢物的检测，为探讨HUA病因、HUA与其他MS组分的关系提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2009年12月—2010年1月和平区事业单位工作人员10例，均为男性，其中健康对照组5例，平均年龄（49.40±3.96）岁；单纯HUA组5例，平均年龄（50.56±5.19）岁。2组年龄差异无统计学意义（t=0.33，P>0.05）。HUA患者血尿酸≥420 μmol/L，且不患有高血压、高血脂、糖尿病等其他慢性非传染性疾病[4]。

1.2 仪器与试剂 INOVA 600 MHz超导核磁共振谱仪，配备脉冲场梯度，带梯度场的三共振探头（美国瓦里安公司）；离心机（德国Eppendorf公司）；重水（D2O，99.9%，美国Cam⁃bridge Isotope Laboratories,Inc公司）；3-三甲基硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸钠（TSP，德国Merck公司）。

1.3 样品采集和配制 清晨空腹取静脉血5 mL，对样品以3 000 r/min离心10 min，取上清液（血浆）300 μL，-80℃冷冻保存。进行氢核磁共振（1H-NMR）实验前，对样品进行室温下解冻，再向编号后的离心管中分别依次加入100 μL TSP的重水溶液（1 g/L），300 μL血清以及200 μL D2O。溶液充分震荡混匀后，14 000 r/min离心10 min，取550 μL上清加入5 mm核磁共振管中待用。

1.4 NMR实验 对每个血浆样本分别采用弛豫编辑脉冲谱（CPMG脉冲谱）（-RD-90°-（τ-180°-τ）n-ACQ）和扩散编辑脉冲谱（LEDbpp脉冲谱）（-RD-90°-G1-180°-G1-90°-T-90°-G1-180°-G1-90°-τ-90°-ACQ）采集血浆样本的数据，分别观测血浆中的小分子代谢物和脂类代谢产物。CPMG实验的谱宽为8 000 Hz，采样点数64 k，采样时间4 s，累加次数64次，τ为200 ms，2 nτ为320 ms，弛豫延迟为2 s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。LEDbpp实验的谱宽为8 000 Hz，采样点数64 k，采样时间4 s，累加次数64次，扩散时间为100 ms，τ为5 ms，弛豫延迟为2 s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。在对自由感应衰减（free induction decay，FID）信号数据进行填零，分别加上1 Hz（CPMG实验）和3 Hz（LEDbpp实验）的线增宽因子后进行傅立叶变换转得到1H-NMR谱图。以乳酸甲基信号双峰的左侧峰定标为δ1.33。

1.5 NMR数据处理 对所得NMR数据经傅立叶变换得到谱图，调整相位并进行基线校正。对CPMG数据，将0.4～4.4范围内的谱按照每段0.04 Pulse Position Modulation（ppm，一种脉冲位置根据被调信号的变化而变化的调制方法）。进行分段积分；对LED数据，将0～6.0范围内的谱按照每段0.04 ppm进行分段积分，并将4.6～5.0之间的谱排除。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得数据输出并转换到Excel文件保存。

1.6 数据分析 将保存的Excel格式数据输入到SIMCA-P+软件（v10.04，Umetrics，Umea，Sweden）进行多元统计分析。数据采用平均中心化（mean centering）或Pareto标度化（Pare⁃to scaling）进行预处理之后行主成份分析（PCA）。对于因受各种因素影响而导致组内个体差异特别大的情况，采用正交信号校正（orthogonal signal correction，OSC）处理后进行偏最小二乘法（PLS）分析。分析结果以得分图（scores plot）和载荷图（loadings plot）的形式表示。

2 结果

2.11H-NMR图谱模式变化图 得分图显示组间代谢模式具有差别，见图1A、B；载荷图示导致上述差别的具体代谢物为极低密度脂蛋白（VLDL，δ0.9、1.3）、乳酸（Lac，δ1.34）、乙醇（Ethanol，δ1.18、3.66）、饱和脂肪酸（SFA，δ1.58、2.22）、N-乙酰糖蛋白（Nac，δ2.06）、谷氨酰胺（Gln，δ2.42、2.46）、卵磷脂（PC，δ3.22）、葡萄糖（glucose，δ3～4），见图1 C、D。

2.2 代谢物变化分析 核磁共振谱图示HUA组较健康对照组的血浆代谢物中SFA、Nac、VLDL、Lac、Ethanol的水平上升，PC、glucose、Gln的水平较健康对照组下降，见图2、3。

3 讨论

1H-NMR代谢组学法是通过分析核磁共振谱图上不同化学位移处的色谱信号，推断相应代谢物水平的高低，从而得到体内代谢组（metabolome）即生物样本、系统、组织或细胞中小分子化合物的总体信息的过程。

由于女性体内雌激素能够促进尿酸排泄，不同性别的HUA患病率不同；吸烟、饮酒、膳食等不同的生活方式对代谢组学的结果均有影响。本组选取有吸烟、饮酒嗜好的男性为研究对象，研究对象早、午均在单位就餐，HUA组生活方式尽可能一致，以均衡生活方式因素对于代谢组学结果的影响。

本研究中对1H-NMR CPMG谱的主成分分析结果显示，HUA组较健康对照组血浆中Nac、Lac、Ethanol的水平上升；PC、Gln、glucose的浓度降低，表明2组血浆代谢物的组成成分能够明显区分两者。对1H-NMR LED谱的主成分分析结果示，从脂类代谢产物上区分了HUA组和健康对照组，表现为HUA组较健康对照组SFA、Nac、VLDL的水平上升；PC的水平下降。

有研究认为血浆中的SFA浓度、VLDL的水平与心血管疾病的发病危险性成正比，而PC则是心血管疾病的保护性因素，且大量流行病学证据和临床研究均证实了HUA是心血管事件的独立危险因素[5]。本研究结果提示HUA组与心血管疾病发生了相同的脂类代谢改变，这从分子水平反映了HUA与心血管疾病的联系。Lac是糖酵解过程正常代谢产物，Lac水平的上升，提示糖酵解加剧，由glucose无氧酵解生成的Lac增多。2型糖尿病常有轻微的高乳酸血症，这可能与Lac的氧化缺陷有关[6]。HUA患者血浆中乳酸水平升高，可能是因为与2型糖尿病有共同的发病机制，也可能是由于病程中具有共同的病生理改变，尚有待进一步研究确认。

综上，HUA患者存在脂类代谢异常、糖酵解加剧等问题，这些代谢物的改变可能与HUA的发病、病程转归有关，也可能为HUA与MS各组分的关系研究提供线索与依据。

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