HlA-DR、CD40和CD1a在桥本甲状腺炎甲状腺滤泡上皮中的表达

徐 魁，周 云

(咸宁学院临床医学院诊断学教研室，湖北 咸宁 437100)

桥本甲状腺炎(HT)属于自身免疫性甲状腺病(AITD)，是最常见的甲状腺疾病。近年来的研究表明，其发病率有逐渐上升的趋势，一定程度上影响着人类健康。因此研究诱致本病发病的相关因素，对于探讨该病的发病机制和临床监测与防治具有重要意义。最近发现HT患者的甲状腺上皮细胞成为抗原递呈细胞(APC)表达抗原，提呈抗原，刺激辅助性T细胞，从而启动自身免疫反应。但是哪些抗原在HT中表达，目前尚不清楚。HLA-DR是T细胞激活的第一信号;CD40是T细胞共刺激分子之一。与MHC-I和MHC-II类分子提呈多肽抗原不同，CD1分子提呈脂质抗原给T细胞。本研究旨在观察CD40、CD1a、HLA-DR是否在桥本甲状腺炎中表达及其与桥本甲状腺炎的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集华中科技大学同济医院病理科甲状腺手术后组织蜡块，桥本甲状腺炎36例(男15例，女21例)，患者年龄20～45岁，其中8例合并甲状腺腺瘤，余无任何合并症及并发症，未服用任何药物，既往身体健康，无特殊疾病史;甲状腺瘤旁正常组织10例(男4例，女6例)，年龄20～45岁，为正常对照组，均经病理切片证实诊断。标本经常规脱水、石蜡包埋、切片。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学方法

石蜡切片常规脱蜡，消除内源性过氧化物酶的活性，抗原修复，加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素(S-A/HRP)染色，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树脂封片。(具体操作步骤按试剂盒说明书进行)。所有一抗为鼠抗人CD40(北京中杉金桥生物技术有限公司)、CD1a和HLA－DR(武汉凌飞科技有限公司)，HRP/DAB二抗通用试剂盒，PBS缓冲液代替一抗做阴性对照组。

1.2.2 定性分析

根据阳性细胞所占百分比为4级。观察全片，无免疫染色阳性细胞或阳性细胞数＜10%者(－);染色阳性细胞较少(＜25%)，阳性较弱且散在分布者为(+);免疫染色阳性细胞较多且分布密集有25% ～50%者为(++);免疫染色很多且分布很密集＞50%的细胞阳性者为(+++)。

1.2.3 定量分析

采用HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统中的免疫组化测量系统，在相同的放大倍数、高度、对比度和饱和度下测量吸光度。每张玻片选择具有代表性的十个不重复的视野进行测量，并计算其平均值和半定量分析。吸光度代表标本中所测量蛋白的相对含量，组织染色越强，吸光度越大，所测蛋白含量越高。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 CD40、CD1a、HLA-DR 在桥本甲状腺炎患者甲状腺组织中的表达

CD40、CD1a、HlA-DR在 HT的甲状腺组织标本中均呈阳性染色(见图1、图2和图3)，阳性物质呈棕黄色颗粒，阳性染色区域主要位于甲状腺滤泡细胞的胞质及胞膜上。正常甲状腺组织几乎不表达 CD40、CD1a、HlA-DR，呈阴性表达，见图4。

图1 CD40在HT甲状腺滤泡上皮呈强阳性着色(HRP×200)

图2 CD1a在HT甲状腺滤泡上皮呈强阳性着色(HRP×200)

图3 HLA-DR在HT甲状腺滤泡上皮呈强阳性着色(HRP×200)

图4 CD40在正常组甲状腺滤泡上皮任何部位都不着色(HRP×200)

2.2 HT和正常对照甲状腺上皮CD1a、HLA-DR、CD40表达水平的定量分析

用t检验分析，结果显示HT患者CD1a、HLADR和CD40阳性率明显高于正常对照组，有显著性差异(P＜0.01)，见表1。

表1 CD1a、HLA-DR、CD40在HT和NTG甲状腺组织中的表达()

表1 CD1a、HLA-DR、CD40在HT和NTG甲状腺组织中的表达()

NC组与组HT比较，*P＜0.01

组别 例数 抗原 平均光度 免疫组化表达强度-+++ +++NC 10 CD1a 0.0023 ±0.0002 9 1 0 010 HLA-DR 0.0023 ±0.0006 9 1 0 010 CD40 0.0024 ±0.0006 8 2 0 0 HT 36 CD1a 0.2651 ±0.0373* 1 9* 16* 10*28 HLA-DR 0.2584 ±0.0412* 0 4* 14* 10*28 CD40 0.2684 ±0.0422* 0 5* 13* 10*

2.3 HT和正常对照甲组状腺上皮 CD1a、HLADR、CD40表达强度半定量分析

本实验发现CD1a在正常甲状腺组织只有非常少的表达，为弱阳性，HT患者绝大多数有CD1a表达，且表达较强，以中度和重度表达为主，中度表达为44.4%，重度表达为27.8%;HLA-DR几乎不表达正常甲状腺组织，但高表达于HT，以中重度为主，中度阳性表达占50.0%，重度表达占35.7%;CD40在HT表达，以中重度为主，中度阳性表达13例，占46.0%，重度35.7%，正常甲状腺组织10例中仅有两例表达弱阳性。卡方检验显示HT和正常组有显著性差异，P＜0.01，见表1。

3 讨论

桥本甲状腺炎是一种T细胞介导的自身免疫性疾病。T细胞激活必须依赖双重信号，HLA-DR是T细胞激活的第一信号，主要在抗原递呈细胞上表达，HLA-DR的表达程度反映了细胞递呈抗原的能力。第二信号来自APC表面表达的共刺激分子如 CD40-CD40L、B7.1-CD28及 ICAM-LFA-1等，没有协同刺激信号的参与则导致T细胞无反应性或细胞凋亡，产生外周耐受，若第二信号刺激过度，则可激活自身反应性T细胞，导致自身免疫的发生。

Tanclon N等研究证明正常人甲状腺滤泡不表达HLA-DR抗原，在桥本甲状炎患者中可见到HLA-DR高表达。苏敏等报道自身免疫甲状腺疾病异常表达DR抗原，以HT最强，其次GD伴甲状腺炎，随着DR抗原异常表达增加，部分GD患者逐渐发展为伴甲状腺炎，最终为HT，说明甲状腺上皮的DR抗原异常表达程度能评估甲状腺免疫病理状态。Bottazo GF等研究证实AITD患者的甲状腺细胞异常表达MHC-II类抗原、粘附分子ICAM-1、VCAM-1。现在多种研究表明桥本甲状腺炎患者表达人白细胞抗原(HLA-DR)的T淋巴细胞增多。

有研究发现CD40分子与AITD有关，Jacobson EM，Tomer Y发现CD40分子有关基因与自身免疫性甲状腺疾病密切相关［1］。Kie JH等人，通过研究10例Graves患者，14例HT患者，11例非特异性甲状腺炎者，11例亚急性肉芽肿甲状腺炎，3例正常患者，发现CD40不表达于正常甲状腺滤泡上皮，但表达于其它甲状腺炎，且发现甲状腺滤泡上皮CD40和Fas-l表达有密切相关［2］。Metcalfe等人用流式细胞仪和TFC扩散计数方法均证实在GD和HT的TFC上有CD40的表达，该实验还显示IFN-γ和IL-la可增加CD40的表达［3］。

另一方面，Smith等人研究结果显示CD40分子在AITD和非AITD中均广泛表达［4］。本研究结果显示CD40分子在HT中高表达，在正常组不表达，提示CD40与HT相关。

CD1在1979年被发现，是单克隆抗体识别的白细胞抗原。CD1分子有4种异构体即CD1a、CD1b、CD1c 和 CD1d。CD1a、CD1b、CD1c 具有同源性较高，而CD1d与前三种分子的同源性较差。Brenner试验室首先将CD1b分子与CD1b特异的脂质抗原结合，发现他们能特异性激活αβ+T细胞，诱导出针对该脂质抗原的特异性免疫应答。现已证实CD1分子与多种自身免疫性疾病相关，如系统性红斑狼疮、干燥综合征、多发性硬化征、Ⅰ型糖尿病等。Roura-Mir C等人研究AITD，发现甲状腺组织中淋巴滤泡外围CD83+树突状细胞高表达 CD1a、CD1b、CD1c，CD20+IgD+CD23-CD38-B细胞高表达CD1c，在自身免疫甲状腺炎早期，甲状腺组织高表达CD1［3］。CD1高表达于桥本甲状腺炎的甲状腺滤泡上皮。

综上所述，HLA-DR、CD40不表达于正常甲状腺滤泡上皮，表达于HT甲状腺滤泡上皮，这些表明HT中的甲状腺上皮细胞成为抗原呈递细胞提供T细胞活化所需的两种信号。因此甲状腺上皮在T细胞激活发挥重要作用。临床结果显示已证实大剂量甲状腺素片可明显抑制甲状腺上皮的DR抗原的表达。CD1a高表达于HT的甲状腺滤泡上皮，可能CD1提呈脂质抗原给T细胞在HT的发病中起一定的作用。

［1］Jacobson EM，Tomer Y.The genetic basis of thyroid autoimmunity Thyroid.J Autoimmun，2007，28(2-3):85

［2］Kie JH，Cho MS，Yang WI Expression of CD40 and apoptosis related molecules in autoimmune thyroid diseases Yonsei Med J，2001，42(5):488

［3］Metcalfe RA，Mcintosh SR，Marelli-berg F，etal.Detection of CD40 on human thyroid follicular cells:analysisof expression and function［J］.J Clin Endocrinol Metab，1998，83(4):1268

［4］Smith TJ，Sciaky D，Phipps RP，et al.CD40 expression inhuman thyroid tissue:evidence for involvement of multiple cell types in autoimmune and neoplastic disease［J］.Thyroid.1999，9(8):749

［5］Roura-Mir C，Catálfamo M，Cheng TY，et al.CD1a and CD1c activate intrathyroidal T cells during Graves＇disease and Hashimoto＇s thyroiditis［J］.Immunol，2005，174(6):3773