葛根素对大鼠急性胰腺炎血浆内皮素和一氧化氮的影响

韩 璐

(咸宁学院基础医学院生理学教研室，湖北 咸宁 437100)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是临床常见急腹症之一［1］，其发病机制尚未完全阐明，一直以来是临床值得进一步探讨的问题。

血浆内皮素(Endothelin，ET)和一氧化氮(Nitric oxide，NO)被认为参与了胰腺微循环障碍的主要因子［2］。AP发生后，胰腺及其他脏器微血管内皮细胞遭受损伤，继而释放细胞因子和血管活性介质，ET和NO分别是重要缩血管介质和舒血管介质。ET使胰腺微血管痉挛，胰腺缺血，减少胰腺血流，使红细胞血流速率及机能毛细血管密度下降，ET还与胰腺ET受体结合，使腺泡细胞内钙超载，损伤胰腺细胞，引起腺泡坏死［3］。而NO具有强烈松弛血管平滑肌细胞、调节微血管的通透性和胰腺血流、抑制白细胞粘附和血小板凝集以及调节胰腺腺体分泌等作用，对AP微循环有保护作用［4］。

葛根素(puerarin)是由豆科植物野葛、甘葛藤根中提取的一种黄酮苷，化学名8-β-D-葡萄吡喃糖-4＇，7-二羟基异黄酮，临床上主要用于冠心病、高血压、高粘血症、脑梗死、糖尿病、缺血性视神经病变等多种疾病治疗。有报道［5］葛根素对大鼠脑和脏器组织NO体系的影响，结果发现葛根素增加组织NOS活性和NO含量。葛根素注射液可通过改善血循环状态对血管内皮细胞结构和功能有保护作用，调节ET、NO代谢失衡状况，从而调节血管舒缩功能［6］。

本实验的目的是通过观察急性胰腺炎大鼠血浆中ET和NO的变化，探讨葛根素对急性胰腺炎胰腺微循环的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

取武汉大学人民医院动物实验中心SPF级雄性SD大鼠54只，体质量200～250g，随机分为急性胰腺炎组(模型对照组，AP组)、假手术组(SO组)、葛根素治疗组(P组)，每组18只。

1.2 试剂及仪器

主要试剂:5%牛磺胆酸钠，葛根素注射液(50mg/2ml北京协和药厂)，6%水合氯醛，NO等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，ET试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司。BS60三用恒温水箱，SZ-97自动三重纯水蒸馏器，超低温冰箱，2T定时漩涡混匀器等。

1.3 实验步骤及方法

AP组:大鼠术前禁食12h，不禁水，用6%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉。在无菌操作下行腹正中切口切开大鼠腹部，显露十二指肠及主胰管。用无损伤小动脉夹先夹闭近肝门处肝总管，以4.5号头皮针经十二指肠乳头逆行穿刺主胰管末端，无损伤血管夹夹闭主胰管末端，缓慢匀速注射5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g)，注射时间为2～3min，完毕后拔除头皮针，无损伤血管夹保留5min。5min后肉眼下可见胰腺组织充血水肿后去掉肝门部和针头插入部位的无损伤血管夹，逐层关腹。造模完毕后皮下注射生理盐水(2ml/100g)补液。大鼠禁食，自由饮水。造模后30min向腹腔注射生理盐水(0.8ml/100g)。

SO组:6%水合氯醛腹腔注射(0.35ml/100g)麻醉后开腹，仅翻动十二指肠。同AP组造模后30min向腹腔注射生理盐水(0.8ml/100g)。

P组:造模方法同AP组，造模后30min向腹腔注射葛根素(20mg/100g)。

各组动物于术后6h、12h、24h 3个时段大鼠分批(每个时间点6只)处死，股动脉采血分离血清于－20℃保存。检测ET和NO的变化;取胰头部胰腺组织用于光镜组织病理学检查。

1.4 统计处理

2 结果

2.1 胰腺组织大体情况

SO组大鼠胰腺肉眼观呈淡粉红色，薄片状，颜色均匀一致，光泽度好，肠系膜及肾周无皂化斑。AP组造模后肉眼可见胰腺明显水肿，呈囊肿样变，伴有出血坏死，后腹膜、肾前筋膜和肠系膜可见皂化区，腹腔有腹水，且随造模时间延长病变逐渐加重;P组大鼠胰腺肉眼观与AP组相似，但病变程度较AP组轻，胰腺水肿、出血坏死范围缩小，后腹膜、肾前筋膜和肠系膜皂化区范围缩小。

2.2 胰腺组织光镜观察及病理评分

SO组光镜下胰腺组织基本正常，AP组可见胰腺腺泡水肿及腺泡结构消失，叶间隔、小叶间隔广泛性扩张，部分胰腺组织腺泡间隔甚至细胞间隔显著增宽;大量炎症细胞浸润，小叶内和血管周围炎症细胞明显增多;腺泡细胞呈不同程度变性坏死，血管外和间隔内出血明显。随着时间的延长，病变呈进行性加重。P组可见叶间隔、小叶间隔广泛性扩张较AP组减轻;胰腺水肿、血管外和间隔内出血及炎症细胞浸润均较AP组减轻，少数偶见局灶性腺泡细胞变性坏死。附图1～3。

图1 SO组胰腺组织切片(HE×200)

图2 AP组胰腺组织切片(HE×200)

图3 P组胰腺组织切片(HE×200)

病理评分:P组3个时间点胰腺病理损伤程度逐渐增强，从6h到12h的变化不明显(P＞0.05)，但从12h到24h比较显著(P＜0.01)，其病损程度均高于同时间点SO组(P＜0.01)，但与同时间点AP组比较，均有所减轻，其差异有统计学意义(6h P＜0.05，12h、24h P＜0.01)，见表1。

表1 3组大鼠胰腺组织病理评分结果()

表1 3组大鼠胰腺组织病理评分结果()

与同时间点SO组比较，*P＜0.01;与同时间点AP组比较，△P＜0.01;与同时间点 AP组比较，#P＜0.05

组 别 胰腺组织病理评分6h 12h 24h AP 组 6.41 ±1.24* 8.83 ±0.98* 10.91 ±1.24*SO 组 0.50 ±0.63 0.75 ±0.61 0.67 ±0.61 P 组 5.25 ±0.76*#6.25 ±0.61＊△ 8.17 ±0.68＊△

2.3 血清ET、NO水平检测结果

P组血清ET水平明显升高，三个时间点之间变化显著(P＜0.01)，与同时间点SO组相比P组ET水平显著升高(P＜0.01);P组与同时间点AP组相比，ET水平较低，其中12h、24h时段最明显，且具有统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表2 3组大鼠血清ET检测结果(pg/ml，)

表2 3组大鼠血清ET检测结果(pg/ml，)

与同时间点SO组比较，*P＜0.01;与同时间点AP组比较，△P＜0.01

组 别 ET 6h 12h 24h AP 组 72.18 ±4.62* 116.55 ±12.22* 125.45 ±13.28*SO 组 30.30 ±3.30 32.71 ±3.91 35.09 ±2.11 P 组 65.90 ±5.81* 88.54 ±6.69＊△ 106.27 ±9.86＊△

P组NO水平逐渐升高，尤其是从12h到24h比较显著(P＜0.01)，与同时间点SO组相比，NO水平显著升高(P＜0.01);与同时间点AP组相比，P组NO水平明显较高，各时间点的差异均具有统计学意义(P＜0.05，其中12h和24h P＜0.01)，见表 3。

表3 3组大鼠血清NO检测结果()

表3 3组大鼠血清NO检测结果()

与同时间点SO组比较，*P＜0.01;与同时间点AP组比较，△P＜0.01;与同时间点 AP组比较，#P＜0.05

6h 12h 24h AP 组 72.65 ±3.20* 87.33 ±6.37* 114.03 ±14.13组别 NO*SO 组 38.52 ±3.12 41.00 ±3.93 45.07 ±3.52 P 组 82.75 ±13.26*#105.34 ±8.08＊△ 129.95 ±7.53＊△

P组血清ET/NO比值在3个时间点的差异不大，无统计学意义(P＞0.05)，与同时间点SO组相比也无显著差异(P＞0.05);P组与同时间点AP组相比，ET/NO比值明显较低，均具有统计学意义(P＜0.01)，见表4。

表4 3组大鼠血清ET/NO()

表4 3组大鼠血清ET/NO()

与同时间点SO组比较，*P＜0.01;与同时间点AP组比较，△P＜0.01

6h 12h 24h AP 组 0.99 ±0.03* 1.33 ±0.06* 1.12 ±0.24组别 ET/NO*SO 组 0.79 ±0.09 0.80 ±0.09 0.77 ±0.02 P 组 0.81 ±0.15△ 0.84 ±0.03△ 0.81 ±0.06△

3 讨论

3.1 ET、NO和急性胰腺炎的关系

急性腺腺炎早期，往往都有微循环的障碍，毛细血管先缺血继而血流淤积，毛细血管通透性增加和微血栓形成。胰腺小叶内微动脉易因高脂血症、动脉粥样硬化和恶性高血压等疾病引起痉挛、栓塞、血栓形成或间质水肿而出现所支配区组织供血不足，这可能是AP发病的始动因子。而胰腺持续缺血可能是AP持续恶化的重要因素，大量的血管活性物质如内皮素、一氧化氮、缓激肽、血小板活化因子等均在胰腺微循环障碍中起重要作用。

ET是一种极强的缩血管介质。Plusczyk等［7］通过研究发现 ET-1、ET-2和ET-3均可导致微循环损害、组织损伤和炎症。Inoue等［8］通过临床观察发现，SAP患者血浆ET-1浓度异常升高，并通过大鼠AP模型检测到胰腺中有ET-1 mRNA表达，因此认为ET-1会加剧内脏微循环障碍并可使胰腺和肠道因持续缺血而最终导致坏死。NO是一种舒血管介质，目前大多数学者认为，低水平的NO通过舒张血管平滑肌降低外周阻力，维持正常血压，减少血小板聚集和改善微循环的途径对胰腺起保护作用。Mettu等［9］通过临床观察证实SAP患者早期血清NO水平升高。

急性胰腺炎病程中，尽管ET和NO水平均明显升高，但ET与NO的比值升高，使得ET的缩血管作用占优势，加重了胰腺微血管的痉挛及内皮细胞的缺血性损伤，微循环血流减慢，胰腺微循环障碍［10］，使细胞因子和血管性介质进一步释放，后者反过来又使微血管内皮受更大的损伤，形成恶性循环。由于胰腺小叶结构的特征决定了胰腺对缺血性损伤的高度敏感性，因此AP病变发展中，ET产生过多，NO生成相对不足，ET与NO平衡失调，使胰腺处于持续缺血状态，胰腺微循环发生障碍，这可能是AP病变进展的重要因素之一。

3.2 葛根素在急性胰腺炎中的作用

已有报告葛根素可以改善微循环，抑制氧自由基的产生，主要应用于心脑血管疾病的治疗［11，12］。葛根素具有纠正ET和 NO 失衡，改善内皮功能的作用。葛根素可通过改善血循环状态对血管内皮细胞结构和功能有保护作用，调节ET、NO代谢失衡状况，从而调节血管舒缩功能［13］。临床研究发现，葛根素能使高血压和不稳定型心绞痛患者的ET显著下降，NO水平显著升高。其作用机理可能是:①葛根素可扩张冠状动脉，增加组织灌注，改善微循环，使内皮细胞的供氧量增加;②使氧自由基生成减少，增加其清除率;③降低血粘度，减轻损伤，内皮功能改善后，合成和释放的NO增加，而ET合成减少。葛根素广泛应用于心脑血管疾病的治疗，但对AP的相关报道少见。

本次实验结果显示葛根素治疗组和AP组与SO组相比，血浆中ET和NO均升高，但是AP组中随着病程演变ET与NO的比例逐渐失调，ET增加水平比NO快，使得病程后期ET的缩血管作用占主要地位，因此胰腺损伤较重。而葛根素治疗组血清ET/NO比值与SO组相比无显著差异(P＞0.05)，胰腺组织损伤较轻。表明了葛根素能使血浆中NO水平升高，以抗衡升高的ET的缩血管作用，纠正了ET和NO代谢失衡，从而改善了胰腺组织的血循环状态，减轻胰腺组织的损伤。

葛根素能使急性胰腺炎大鼠血浆中NO水平增高，以抗衡ET的缩血管作用，从而改善胰腺微循环，降低胰腺组织的损伤。

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