低氧诱导因子-1α在糖尿病肾病中的表达及其意义＊

赵辛元，李伟民，李彩蓉，余亚娟

(咸宁学院临床医学院内科学教研室，湖北 咸宁 437100)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的最常见的微血管并发症，大量实验证实糖尿病肾病存在新生血管生成，而缺氧时微血管病变对肾脏疾病进展起着重要作用。低氧促进展的作用主要通过低氧诱导因子(HIF-1α)/低氧反应元件(HRE)途径［1］。持续稳定表达HIF-1α的基因敲除小鼠肾脏纤维化加重，提示HIF-1α是一个新的调节肾脏纤维化因子［2］。因此，研究DN大鼠肾脏中HIF-1α表达的变化，明确低氧与糖尿病微血管并发症的相关性，对有效防治和(或)延缓DN具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

动物为清洁级近交系雄性Wister大鼠30只，体质量180～210g(由湖北省医学科学院实验动物中心提供);主要试剂为HIF-1α兔抗小鼠多克隆抗体(ZYMED LABORATORIES公司)。

1.2 糖尿病肾病大鼠模型的建立

清洁级近交系雄性Wister大鼠30只，每笼5只，饲养于标准环境，12h光照周期。随机分为糖尿病模型组和正常对照组，每组15只。糖尿病模型组给予单次左下腹腔注射60mg/kg的链尿佐菌素(STZ)，注射后第3d测尾静脉血糖，若血糖低于＜11.1mmol/L者被排除;正常对照组腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，所有动物于8周处死。

1.3 标本采集

于实验第8周麻醉后剪断颈动脉取全血6～8ml，离心分离血清，待测各项指标。并处死动物，迅速取出肾脏，待检。处死前夜大鼠禁食过夜，自由饮水。

1.4 观察指标

①生化检测:BUN、Scr采用Beckmam全自动生化分析仪测定，并计算内生肌酐清除率;血糖测定采用美国罗氏公司血糖测定仪。②肾脏组织形态学观察:石蜡包埋肾组织切片行HE染色，在光镜下观察肾脏组织形态学改变。③免疫组化检测肾脏组织HIF-1α:采用SP法检测HIF-1α蛋白按SP法试剂盒说明书进行操作，结果以同济千屏HPIAS2000型图像分析软件半定量分析。光镜下HIF-1α表达主要位于细胞质和/或细胞核，以黄色、棕色、棕褐色为阳性表达，其表达结果由染色细胞评判:分别随即观察每例高倍镜(×400)下5个视野，计算阳性细胞数与总细胞数百分比。④Western Blot检测:考马斯亮兰法测定各样品蛋白质含量，Western Blot分析HIF-1α的表达，免疫印迹条带IOD值最后用Gel-Pro Analyzer3.1图像分析系统分析。其相对含量分别用其与β-actin吸光度×面积之比值表示。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 生化指标

糖尿病组大鼠的血糖、内生肌酐清除率、尿素氮水平均较对照组明显升高(P＜0.05)，见表1。

表1 两组大鼠生化指标比较()

表1 两组大鼠生化指标比较()

与对照组比较，*P＜ 0.05;＊＊P＜ 0.01

组别 BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) Ccr(ml/min) GLU(mmol/L)6.18 ±0.29 13.78 ±1.98 28.84 ±1.56 5.46 ±0.34糖尿病组 24.56±2.34＊＊ 33.58 ±2.76＊＊ 8.40 ±1.57＊＊ 19.87±3.15对照组*

2.2 HIF-1α 免疫组化表达

免疫组化显示HIF-1α在糖尿病大鼠肾脏皮质小管和皮髓之交界处肾小管上皮细胞核表达明显增加，其阳性细胞数量明显增加，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，见表2。

2.3 HIF-1α 蛋白 Western Blot表达

糖尿病大鼠模型组HIF-1α的表达量明显高于对照组(P＜0.05)，见表2。

表2 两组大鼠肾脏组织中HIF-1α蛋白表达()

表2 两组大鼠肾脏组织中HIF-1α蛋白表达()

与对照组比较，*P＜ 0.05;＊＊P＜ 0.01

0.005 ±0.001 0.087 ±0.007糖尿病组 0.236 ±0.020* 2.354 ±0.960-actin对照组组别 HIF-1α阳性细胞数/总细胞数HIF-1α蛋白/β＊＊

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病最常见的致死、致残的并发症之一，本实验采用STZ成功建立了1型糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠组血糖显著升高、肾功能损害，显微镜下可见肾小球基底膜增厚、系膜基质增加，系膜区明显扩宽，部分毛细血管塌陷，符合糖尿病肾病的病理特点，提示实验性糖尿病大鼠肾脏损伤模型成功建立。HIF-1α是细胞和组织在缺氧状态下的主要调节因子，研究证明，HIF-1α参与调节缺氧相关基因的表达，减轻缺氧对机体造成的损伤;可以在缺氧状态下多种组织细胞中表达，如肾、肝、脑、肺、心和视网膜组织，是缺氧状态下许多细胞发生糖分解和新生血管形成的关键因素［3］。我们通过免疫组化和westerblot检测了大鼠肾脏组织中HIF-1α的表达，发现在糖尿病模型组，HIF-1α蛋白表达明显增加，提示HIF-1α参与糖尿病肾脏微血管病变的发生发展。但是HIF-1α参与微血管病变的机制尚需进一步研究。

［1］Takiyama Y，Harumi T，Watanabe J，et al.Tubular injury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by metformin:a possible role of HIF-1α expression and oxygen metabolism［J］.Diabetes，2011，60(3):981

［2］Katavetin P，Miyata T，Inagi R，er al.High glucose blunts vascular endothelial growth factor response to hypoxia via the oxidative stress-regulated hypoxia-inducible factor/hypoxia-responsible element pathway［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17(5):1405

［3］Sumual S，Saad S，Tang O，et al.Differential regulation of Snail by hypoxia and hyperglycemia in human proximal tubule cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(10):1689