鼻咽癌Survivin基因表达与预后关系的研究

蔡俊宏，符生苗*，涂志华，邓立群，梁 茱，陈显钊，龚选举

（海南省人民医院医学检验部1、放疗科2、病理科3，海南 海口 570311）

Survivin是1997年新发现的一种凋亡抑制基因[1]，定位于染色体17q25，为凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis，IAPs)成员之一，可通过杆状病毒IAP重复序列(Baculoviral IAP repeat，BIR)直接与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)中的Caspase-3、Caspase-7等结合，参与抑制细胞凋亡的核心机制，使得细胞凋亡受到抑制。鼻咽癌（Nasopharyngeal Carciaoma，NPC）是我国南方和东南亚很常见的恶性肿瘤，至今发病机制仍不清楚，疗效也不甚理想，5年生存率仍徘徊在50%～60%。本研究通过检测鼻咽癌活检组织中Survivin蛋白及mRNA的表达情况来探讨凋亡抑制基因Survivin与鼻咽癌患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 44例研究病例均来自2006年5月至2007年9月海南省人民医院耳鼻喉科门诊患者鼻咽部活体组织检查标本，经病理诊断确诊，37例为低分化鳞状细胞癌，7例为分化性非角化性癌，其中男30例、女14例，平均48岁(22～77岁)。临床诊断分期按92福州分期，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期15例。所有患者确诊后均在我院放疗科行放射治疗，出院后随访至2010年10月。另取30例同期鼻咽部慢性炎症组织做对照。

1.2 试剂 多聚赖氨酸玻片、兔抗人Survivin多克隆抗体、UltraSensitiveTMS-P免疫组化染色试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。Survivin mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 方法 Survivin蛋白免疫组织化学：采用SP法检测，石蜡包埋组织标本切片常规脱蜡水化、柠檬酸组织抗原修复液修复，内源性过氧化物酶阻断溶液室温孵育10 min，正常非免疫动物血清室温孵育10 min，兔抗人Survivin多克隆抗体4℃孵育过夜，生物素标记二抗室温孵育10 min，链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液室温孵育10 min，DAB显色、苏木素复染、脱水透明、封片，显微镜观察。Survivin mRNA原位杂交：石蜡包埋组织切片后按常规方法脱蜡水化、灭活内源性酶、胃蛋白酶消化及1%多聚甲醛固定。39℃预杂交 2 h，39℃杂交过夜，37℃封闭 30 min，37℃生物素化鼠抗地高辛液反应1 h，37℃链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）反应20 min，室温生物素化过氧化物酶孵育30 min，然后用DAB显色、苏木素复染、脱水透明、封片，显微镜观察。在400×高倍显微镜下观察肿瘤细胞5个视野，每个视野计数100个细胞，若鼻咽癌细胞浆或细胞核内有棕黄色颗粒或斑片为阳性细胞，计算阳性细胞占总的计数鼻咽癌细胞的百分率，＞50%为(+++)、26%～50%为(++)、6%～25%为(+)、≤5%为(-)，其中0%～25%为低表达，25%以上为高表达。

1.4 统计学方法 采用SAS8.0统计分析软件对4格表数据进行χ2检验，两组数据比较采用t检验分析。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织中Survivin的表达情况 Survivin蛋白的表达情况：9例(-)、5例(+)、10例(++)、20例(+++)，低表达共14例，高表达共30例。30例同期鼻咽部慢性炎症组织中仅11例表达为(+)；Survivin mRNA原位杂交情况：11例(-)、6例(+)、13例(++)、14例(+++)，低表达共17例，高表达共27例。30例同期鼻咽部慢性炎症组织中仅10例表达为(+)，见表1。且Survivin蛋白与mRNA水平表现出很好的一致性，同为阴性（9例）和同为阳性（32例）的比率达到90.9%。

表1 Survivin蛋白的表达与mRNA原位杂交情况（%）

2.2 Survivin基因表达的高低与鼻咽癌患者生存时间的关系 Survivin蛋白高表达的鼻咽癌患者平均生存时间为28.9个月，明显低于Survivin蛋白低表达者的44.5个月；Survivin mRNA高水平的鼻咽癌患者平均生存时间为29.9个月，明显低于Survivin mRNA低水平者的40.1个月，见表2。

表2 Survivin基因表达的高低与鼻咽癌患者生存时间的关系（±s）

表2 Survivin基因表达的高低与鼻咽癌患者生存时间的关系（±s）

检测项目 表达高低 平均生存时间(月)P值Survivin蛋白 ＜0.01 Survivin mRNA高表达低表达高表达低表达28.9±11.7 44.5±3.6 29.9±12.4 40.1±10.8＜0.01

3 讨 论

细胞凋亡在生理或病理条件下都会发生，细胞内诱导途径在促细胞凋亡信号的刺激下线粒体会释放细胞色素C，连接并激活凋亡蛋白酶激活因子，启动凋亡效应因子Caspase-9、Caspase-3和Caspase-7从而引起细胞凋亡[2]。在这个过程中Survivin可以直接抑制效应因子Caspase-3、Caspase-7相关核心机制来阻止细胞的凋亡[3]。除此之外，Survivin还可阻碍线粒体释放细胞色素C，与线粒体释放的辅助性线粒体源性Caspase激活因子SMAC（Second mitochondria-derived activation of caspase）结合，保护IAPs免于被SMAC抑制，从而起到对Caspase的间接抑制作用。Survivin一般表达于人和哺乳动物的胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织中，而不表达在分化成熟的成人正常组织中[4-7]。Shin等[8]的研究表明Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，而其分子靶Caspase是细胞凋亡的核心机制，能够级联式激活并溶解蛋白，决定细胞凋亡的变化和趋势。张帅等[9]运用免疫组织化学和TUNEL法对51例鼻咽癌活检组织标本进行Survivin蛋白及凋亡指数的相关研究，结果发现在鼻咽癌组织中Survivin蛋白表达阳性率为82.4%，其中高表达占51%，凋亡指数平均为2.6%，Survivin蛋白表达与凋亡指数存在相关性，且与患者预后具有密切的相关性（P＜0.05）。本研究结果显示，在44例鼻咽癌中Survivin蛋白表达阳性率为79.5%，其中高表达为68.2%，Survivin mRNA的表达阳性率75.0%，其中高表达为61.4%，与上述结果相近。本课题组应用实时荧光定量RT-PCR方法检测Survivin mRNA的表达，也发现鼻咽癌细胞株、鼻咽癌活检组织组均较鼻咽部慢性炎症组织高（P＜0.05），研究结果已另文发表[10]。这些研究结果提示凋亡抑制基因Survivin在鼻咽癌的发生、发展过程中具有调控肿瘤细胞凋亡的重要作用。

我们通过随访调查了入选研究组每位患者的生存状态，进一步研究Survivin基因表达与鼻咽癌患者预后之间的关系，从而讨论Survivin作为鼻咽癌预后判断指标的可能性。研究结果发现Survivin蛋白高表达的鼻咽癌患者的平均生存时间为28.9个月，明显低于低表达的44.5个月；Survivin mRNA高水平的鼻咽癌患者平均生存时间为29.9个月，明显低于Survivin mRNA低水平者的40.1个月。Kato等[11]在食管癌中也发现Survivin低表达的病人平均生存时间为30个月，明显高于Survivin高表达患者的9个月。对于鼻咽癌来说，尽管其对放射治疗相对敏感，但鼻咽癌患者5年生存率仍只有50%～60%，其原因可能就是由于部分鼻咽癌细胞对放射治疗存在放射抗拒。Asanuma等[12]证实了Survivin是胰管癌细胞产生放射抗拒的重要因素，而且在体外实验中Survivin mRNA的表达量与肿瘤细胞对放射的敏感性成反比，在亚致死剂量放射线下表达增强，说明Survivin也是一种诱发放疗抗拒的重要因素。这些研究结果说明Survivin高表达可以明显影响细胞凋亡，同时也可能是肿瘤细胞对放射治疗产生放疗抗拒和耐受性的重要原因。此外，徐澍等[13]还应用免疫组织化学检测了58例Ⅲ期鼻咽癌患者活检组织p53蛋白表达情况，结果发现生存期＜5年者阳性率为82.1%，远高于＞5年者的31.6%。何侠等[14]还发现157例鼻咽癌标中生存期＜3年者p16基因第2外显子的缺失率为69.57%，明显高于生存期＞3年者的29.10%（P＜0.01）。齐斌等[15]采用聚合酶链式反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)技术，检测了203例晚期鼻咽癌初治患者活检组织放化疗通路或顺铂/氟尿嘧啶通路13个基因、18个SNP位点，用Kaplan-Meier法进行生存分析，Cox回归进行多因素分析，发现有rs25487 AA、rs1136410 CC+TT、rs2032582 ATrs2010963 CC、rs3212986GG、rs2279744 GG+GT等6个基因型为预后的独立危险因素(P＜0.05)。故而我们认为Survivin主要影响细胞凋亡途径中下游效应因子Caspase-3、Caspase-7等，并与其他相关基因之间也可能有相互作用，但是它们之间的关系及鼻咽癌的确切发病机制如何，需要我们增加研究病例并延长随访时间进一步的研究探讨。

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