酿酒酵母SC408转化3-甲硫基丙醇条件的研究

侯 晟, 赵 磊, 杨雪莲, 王成涛

关于酵母菌转化3-甲硫基丙醇已有一些报道.Castillo-lozano等[8]对5株酵母菌进行摇瓶培养,48 h后发现有少量3-甲硫基丙醇生成;Buzzini等[9]从37株担子菌酵母(basidiomycetous yeasts)中发现有10株能够转化氨基酸生成3-甲硫基丙醇,恒温25℃,40 r/min摇床培养72 h,产量为0.04～0.40 g/L;Etschmann等[10]研究了酿酒酵母CEN.PK113-7D补料分批发酵条件,在5 L发酵罐中26～36 h向罐中流加葡萄糖,最终在64 h获得3.5 g/L的3-甲硫基丙醇.本研究利用筛选获得的一株产3-甲硫基丙醇的酵母菌,通过均匀试验设计优化其培养基和转化条件,希望为微生物转化生产天然香料3-甲硫基丙醇提供技术支持.

1　材料与方法

1.1　材料

甲醇、乙腈为色谱纯,美国Fisher公司;氨基酸,天津市光复精细化工研究所;产香酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC408由中国农业大学惠赠;酵母膏,北京奥博星生物技术有限责任公司;其他试剂均为分析纯.

1.2　仪器设备

Waters 2695型四元高效液相色谱仪,2996型光电二极管阵列检测器,SunFireTMC18(5μm,4.6×150 mm)色谱柱,美国Waters公司.

1.3　HPLC分析方法

流动相为乙腈:水.梯度洗脱条件:2%乙腈,2 min;2% ～12%乙腈,2 min;12% ～40%乙腈,5 min;40%～50%乙腈,3 min;50% ～2%乙腈,2 min;2%乙腈,2 min;流速1 mL/min;柱温30℃;检测波长210 nm;进样量10μL.

1.4　培养基的制备

种子培养基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%(斜面固体培养基另加2%琼脂).

培养基Ⅰ:根据前期试验摸索,设计培养基成分均匀设计方案,如表1中各试验号.

表1　培养基组分均匀设计方案Tab.1　Design proposal of fermentation on media

将一定量的氨基酸、KH2PO4、K2HPO4、MgCl2、FeCl2、ZnSO4和酵母膏溶于100 mL去离子水中,置于121℃灭菌20 min,冷却后,倒入已灭菌的含有1 g葡萄糖和0.8 g NaCl的250 mL三角瓶中,混匀即为各试验号发酵用培养基.每个试验号2组平行.

培养基Ⅱ:按表1中试验号为2的成分配制,操作同上.

培养基Ⅲ(100 mL):氨基酸0.4%、KH2PO40.8%、K2HPO40.6%、MgCl20.001%、FeCl20.002%、ZnSO40.003%和酵母膏0.08%溶于装有100 mL去离子水的250 mL三角瓶中,置于121℃灭菌20 min,冷却后倒入装有按表2设计的已灭菌葡萄糖和NaCl的250 mL三角瓶中,混匀,即为各试验号发酵用培养基.每个试验号2组平行.

1.5　培养优化方法

1.5.1培养基组分的均匀试验设计方案

根据前期发酵试验结果,从斜面种子培养基挑取1环接种于上述“培养基Ⅰ”中,30℃,200 r/min摇床培养,分别于60,72和84 h取样,HPLC检测.

表2　培养条件均匀设计方案Tab.2　Design proposal of fermentation condition

1.5.2接种量对3-甲硫基丙醇发酵和氨基酸转化率的影响实验

按照2.4培养基的制备方法制备培养基,将30℃,200 r/min摇床培养24 h的种子培养液按5%和10%分别接种于“培养基Ⅱ”中,同时分别挑取1环、2环和5环的固体斜面种子接种于“培养基Ⅱ”中,30℃,200 r/min摇床培养,在12,24,48,60,72和84 h分别取样,HPLC检测.

1.5.3培养条件对3-甲硫基丙醇发酵的影响实验

按照1.4培养基的制备方法制备培养基,将30℃,200 r/min摇床培养24 h的种子培养液按5%接种于各“培养基Ⅲ”中,按表2培养条件进行培养发酵,在48,60和72 h分别取样,然后从摇床取出在室温静置培养,分别于140和384 h取样,HPLC检测.

1.5.4优化条件的验证实验

按照1.4培养基的制备方法制备培养基,将30℃,200 r/min摇床培养24 h的种子培养液按5%接种于“培养基Ⅲ”中较优一组,30℃,200 r/min摇床培养,在12～132 h间每12 h取样(分两批,一批前72 h取样,一批后60 h取样),HPLC检测,并测定生物量.

1.6　发酵液的处理及生物量的测定

将发酵液8 000 r/min离心10 min,上清液用0.45μm微孔滤膜过滤得液相色谱待测样液,沉淀物置于105℃干燥箱,干燥至恒重,称量即得生物量.

2　结果与分析

2.1　培养基组分优化结果

培养基组分的均匀设计试验结果如图1,除7号试样外,其余各试验号发酵液3-甲硫基丙醇浓度在0.70～0.89 g/L,但达到峰值的时间不同,2,3,4,5,8,9,10和11号试样在60 h达到峰值,1和6号试样在84 h达到峰值,7号试样随着发酵时间的延长产物浓度在升高,但其峰值仅为0.54 g/L.为缩短发酵时间,提高氨基酸转化率,选择2号培养基作为后续试验的基础培养基.

图1　培养基组分优化试验3-甲硫基丙醇生成的动态曲线Fig.1　Dynamic curve of accumulation of methionol on media optimization

培养基组分优化均匀设计试验各因素多元线性回归参数分析结果如表3.表3表明,在初始葡萄糖质量浓度为10.0 g/L时,3-甲硫基丙醇浓度与KH2PO4、ZnSO4和酵母膏的浓度呈正相关,与K2HPO4,MgCl2和FeCl2的质量浓度负相关,但与氨基酸浓度无关,提示其氨基酸是过量添加.

表3　培养基组分均匀设计试验各因素多元线性回归参数分析Tab.3　Parameters of linear aggression on media proportion optimization

2.2　接种量对3-甲硫基丙醇发酵的影响

接种量对3-甲硫基丙醇发酵的影响见图2.图2可以看出,接种量对3-甲硫基丙醇的峰值影响不大(维持在0.9～1.1 g/L),但峰值出现的时间不同.接种5环的试样在48 h达到峰值,接种1环、2环、5%和10%的试样在60 h达到峰值,5%接种量试验组生成的目标产物浓度最高(P＜0.05),因此后续试验中选择5%接种量.

图2　接种量对3-甲硫基丙醇发酵的影响Fig.2　Effect of inoculation amounts on 3-(methylthio)-1-propanol accumulation

2.3　培养条件对3-甲硫基丙醇发酵的影响

培养条件对3-甲硫基丙醇发酵的影响结果见图3.图3显示,4号和6号试验组的3-甲硫基丙醇浓度明显高于其他试验组,这两组产量的发酵条件发现,其初始葡萄糖质量浓度都大于等于20.0 g/L,转速也较高(200 r/min),因此,高含量的葡萄糖有利于菌体生长和3-甲硫基丙醇累积,高溶氧量有利于3-甲硫基丙醇的累积,温度适中有利于3-甲硫基丙醇的生成.

2.4　优化条件的验证结果

优化条件下发酵底物、目的产物和生物量的同步生长关系见图4.由图4可见,随着发酵时间延长,3-甲硫基丙醇浓度与生物量同步增长(图4;r=0.94,P＜0.05),表明3-甲硫基丙醇随着菌体细胞生长而不断累积,在132 h达到1.6 g/L;氨基酸的摩尔转化率约为72%;从氨基酸的消耗量来看,补料流加氨基酸后,3-甲硫基丙醇仍会继续生成.

图3　培养条件对3-甲硫基丙醇发酵的影响Fig.3　Effect of concentration of methionol on different cultivation condition

图4　优化条件下发酵底物、目的产物和生物量的同步生长关系Fig.4　Optimized results of concentration of amino acid,methionol and biomass with fermentation time

3　结 论

通过均匀试验设计优化Saccharomyces cerevisiae SC408的培养基组分为:氨基酸4.0 g/L、KH2PO48.0 g/L、K2HPO46.0 g/L、MgCl20.01 g/L、FeCl20.02 g/L、ZnSO40.03 g/L、酵母膏 0.8 g/L、葡萄糖30.0 g/L和NaCl 2.0 g/L;研究了接种量和培养条件对3-甲硫基丙醇产生的影响,在摇床培养30℃,转速200 r/min,132 h时3-甲硫基丙醇的产量达到1.6 g/L,氨基酸的摩尔转化率约为72%.同时,研究发现若控制好底物中葡萄糖浓度和氨基酸浓度,3-甲硫基丙醇的终产物浓度还会继续升高,为今后分批-补料发酵的扩大试验提供有力的支持.

参考文献: