微生物合成3-甲硫基丙醇的研究现状

马景浩，王 洋，张玉姣，成柳洁，滕 超，李秀婷，范光森*

（1.北京工商大学 食品与健康学院，北京 100048；2.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；3.济南海关技术中心 德州实验室，山东 德州 253000）

3-甲硫基丙醇（俗称菠萝醇）是一种重要的含硫高级醇，常温下为易流动的淡黄色液体，低浓度时具有强烈的肉类芬芳香气，天然存在于苹果、番茄、酱油、奶酪、白酒、葡萄酒、啤酒、威士忌、白兰地等食品或饮料中，能赋予众多食品其特有的风味[1]。3-甲硫基丙醇香气阈值低，在1～3 mg/L之间即可表现出一种令人愉悦的、肉类的或者烤制奶酪的香气，是调配肉味香精的重要香料之一，是国家允许使用的食品用香料，广泛应用于香精香料调配和食品增香，是一类应用非常广泛的食用香料化合物，市场需求量大[2-3]。

目前，3-甲硫基丙醇的生产方法包括化学合成法和微生物发酵法，其中化学合成法是目前3-甲硫基丙醇生产的主要方法。化学合成法虽然成本低，但却存在合成过程污染较大等问题，不能满足消费者日益对环保、绿色和纯天然香精香料青睐的需求。由于生物转化制备天然3-甲硫基丙醇具有构型单一、绿色环保，成为近年来生产3-甲硫基丙醇的重要发展方向[4]。相关研究表明，微生物，尤其是酵母能代谢L-蛋氨酸发酵合成3-甲硫基丙醇，是生物转化生产天然3-甲硫基丙醇的有效途径。目前，有关微生物发酵合成3-甲硫基丙醇的研究相对较少，需要对其进行深入研究。本文正是基于微生物合成3-甲硫基丙醇的重要性，通过对微生物合成3-甲硫基丙醇的主要微生物及其代谢途径中的关键酶进行简述，加强对微生物产天然3-甲硫基丙醇研究现状的了解，为相关研究提供参考。

1 3-甲硫基丙醇在食品中的作用

3-甲硫基丙醇具有强烈的甜香、汤或肉样香气，早在1973年美国食用香料与提取物制造者协会（Flavour and Extract Manufactuere's Association，FEMA）将其确定为一般认为安全的香料物质，在食品中建议用量为0.1～50 mg/kg[5]，1986年，我国相关食品国家标准也将其列为暂时允许使用的食品香料。3-甲硫基丙醇特有的肉香味及其低阈值特性，对众多食品呈现独特的风味发挥了重要的作用，如在切达干酪、蓝奶酪、卡门培尔干酪等奶酪中呈现发酵卷心菜的独特气味，能很容易在奶酪中被辨识出，是奶酪整体风味的重要组成部分[6-7]；尽管3-甲硫基丙醇是否是芝麻香型白酒中的特征风味物质存有争论，但其在部分品牌芝麻香型白酒的风格形成中发挥着重要作用，并且在豉香型白酒及果酒的呈味中也具有重要的贡献，表现出花椰菜和煮熟蔬菜的香气，对风味品质的贡献显著[1，8]；3-甲硫基丙醇是黄酒中的重要含硫化合物，在清爽型黄酒中香气强度较高，主要赋予黄酒青香和煮熟蔬菜的气味，丰富黄酒的香气[9]；3-甲硫基丙醇也是葡萄酒中重要的风味物质，能赋予葡萄酒煮土豆味，丰富其风味[10]。除此之外，因其具有甜的肉及肉汤气味，3-甲硫基丙醇是调配肉味香精的重要原料，还可用于调配诸如水果、蔬菜、酱油、酒等众多食用香精，用途广泛[11]。

2 3-甲硫基丙醇的生产方法

2.1 化学合成法

化学合成方法因具有成本低、合成快、产物浓度高的优势，一直是3-甲硫基丙醇主流的生产方法。目前，有关3-甲硫基丙醇的化学合成方法主要有四种：①采用甲硫醇和烯丙醇的加成反应。②利用3-氯-1-丙醇和甲硫醇钠在醚中进行取代反应。③采用烯丙基甲基硫醚的分解反应。④3-巯基-1-丙醇和硫酸二甲酯的取代反应（图1）[11]。其中，前两种反应是目前实际生产中所采用的方法，相关研究也较多。刘玉平等[11]以3-氯-1-丙醇和甲硫醇钠为原料，在相转移催化剂四甲基溴化铵的作用下发生取代反应，制得了纯度较高的3-甲硫基丙醇，产率达到81%。虽然，化学合成成本低廉，但存在的一些诸如原料毒性高、生产过程中的毒副产物难以去除及污染较大等问题引起关注，在一定程度上限制了其在工业化生产中的长期使用，必须拓展新的生产方法[12]。

图1 3-甲硫基丙醇的4种化学合成方法Fig.1 Four chemical synthesis methods for 3-methithiopropanol

2.2 微生物合成法

有关研究表明，微生物可以将甲硫氨酸转化为3-甲硫基丙醇[7，13]。如，BUZZINI P等[13]筛选获得10株能够转化氨基酸生成3-甲硫基丙醇的酵母菌株，产量在0.04～0.40 g/L。虽然，当前微生物转化合成3-甲硫基丙醇的速率不及化学方法，但由于其具有反应条件温和、产物构型单一、绿色环保、所用原料安全无污染等特点，成为近年来制备“绿色”和“天然”的3-甲硫基丙醇的重要发展方向。

2.2.1 生产3-甲硫基丙醇的天然菌株

当前，国内外有关微生物转化生产天然3-甲硫基丙醇的研究相对较少，能够产生3-甲硫基丙醇的微生物种类不多，主要集中于酵母菌株（表1）。已报道能够产3-甲硫基丙醇的菌株包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、酒类酒球菌（Oenococcus oeni）、担子菌酵母（Basidiomycetous yeasts）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、拟威尔酵母（Williopsis）等[4，13-21]。目前，天然微生物转化生产3-甲硫基丙醇的能力相对较弱，CASTILLO-LOZANO M L D等[7]通过摇瓶发酵培养5株酵母菌株，其中乳酸克鲁维酵母KL640和酿酒酵母SC45能转化生成3-甲硫基丙醇，产量分别为14.51 mg/L和25.70 mg/L；BUZZINI P等[13]从37株担子菌酵母中获得10株可以生成3-甲硫基丙醇的酵母，其产量在0.04～0.40 g/L；侯晟等[4]优化了酿酒酵母SC408发酵合成3-甲硫基丙醇的条件，在最优条件下，该菌株所产3-甲硫基丙醇的量达到1.6 g/L；为进一步提高酿酒酵母SC408发酵合成3-甲硫基丙醇的产量，王成涛等[22]采用发酵-分离耦合技术降低3-甲硫基丙醇对细胞的毒害作用，最终产量可达2.26 g/L，为已报道天然菌株中所产3-甲硫基丙醇最高产量；另外，WILLIAMS A G等[23]从切达干酪中分离获得29株能产3-甲硫基丙醇的乳酸菌，产量也较低，在0.04～0.30 g/L之间。天然菌株所产3-甲硫基丙醇普遍低的现象（几乎都低于0.1 g/L），成为采用天然菌株进行工业化生产3-甲硫基丙醇最主要的限制因素[24]。

表1 产3-甲硫基丙醇的天然菌株Table 1 Natural strains that produce 3-methylthiopropanol

续表

2.2.2 生产3-甲硫基丙醇的基因工程菌

随着人们对天然生产的3-甲硫基丙醇的需求增加以及基因工程技术的不断发展，越来越多的学者开始采用分子生物学技术对菌株进行改造，以此实现高产3-甲硫基丙醇的工程菌株。刘丽等[26]通过过表达酿酒酵母S288C中的氨基转移酶ARO8基因构建工程菌ARO8，工程菌所产3-甲硫基丙醇达到0.76 g/L，相比野生型S288C提高了28.8%；温明显等[3]通过过表达酿酒酵母INVSc1中的脱羧酶基因ARO10构建了酿酒酵母转化子SC10-1，其产3-甲硫基丙醇的量相比天然菌株提高了55.2%，达到0.90 g/L；YIN S等[27]通过共表达氨基转移酶基因ARO8和ARO10构建了酿酒酵母转化子S810，在摇瓶水平上，该工程菌所产3-甲硫基丙醇达到1.27 g/L，通过分批补料发酵罐培养，产量达到3.24 g/L；ETSCHMANN M M W等[24]通过分批补料发酵方法实现了工程菌酿酒酵母CEN.PK113-7D高产3-甲硫基丙醇的目的，产量可达3.5 g/L；杨雪莲等[28]优化了过表达脱羧酶基因ARO10的酿酒酵母工程菌合成3-甲硫基丙醇的发酵条件，在最优条件下，工程菌株所产3-甲硫基丙醇可达4.38 g/L，为已报道中的最高水平。部分产3-甲硫基丙醇的基因工程菌株见表2，由表2可知，通过基因改造可以实现3-甲硫基丙醇产量的大幅度提高，为工业化应用微生物转化生产3-甲硫基丙醇打下基础。

表2 产3-甲硫基丙醇的基因工程菌株Table 2 Genetically engineered strains producing 3-methylthiopropanol

3 微生物生物转化生产3-甲硫基丙醇的关键基因和酶

在酵母细胞中，Ehrlich途径是生物转化生成高级醇的最重要的途径[2]。3-甲硫基丙醇是高级醇的一种，可以由蛋氨酸经过Ehrlich途径代谢产生[34]。在3-甲硫基丙醇的生物合成过程中，如果没有蛋氨酸，3-甲硫基丙醇几乎不产生，这足以表明Ehrlich途径在合成3-甲硫基丙醇中的重要性[24]。在Ehrlich途径中，首先，蛋氨酸在氨基转移酶（aminotransferase）作用下发生转氨基作用生成α-酮-γ-甲硫基丁酸（α-keto-γ-（methylthio）butyrate，KMBA），然后在脱羧酶（decarboxylase）作用下生成3-甲硫基丙醛，最后在乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）作用下发生还原反应生成3-甲硫基丙醇[24，35]。

图2 微生物转化L-蛋氨酸产3-甲硫基丙醇的Erich途径Fig.2 Erich pathway of microbial transformation of L-methionine to produce 3-methylthiopropanol

3.1 氨基转移酶

在Ehrich途径中具有转氨作用的基因有4种，分别为BAT1、BAT2、ARO8和ARO9[2]。CHOLET O等[36]对汉斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中的86个基因进行了脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）微阵列分析，发现能高效同化L-蛋氨酸的解脂耶氏酵母中，与酿酒酵母同源的基因BAT2和ARO8表达量较高，表明这两种转氨酶在酵母通过Ehrich途径转化蛋氨酸生成3-甲硫基丙醇中起到一定的作用。研究表明，基因BAT1编码线粒体氨基转移酶BAT1p，优先参与支链氨基酸（BCAAs）的生物合成，BAT2则编码细胞质氨基转移酶BAT2p，参与BCAAs的分解代谢，两者在3-甲硫基丙醇的合成中起到的作用较小，而在合成其他高级醇中的作用显著[37-40]。基因ARO8和ARO9则分别编码Aro8p和Aro9p，两者作用的底物是芳香族氨基酸，分别被称为芳香族氨基酸转移酶Ⅰ和Ⅱ[41-42]。Aro8p属于组成型表达蛋白，是主要的芳香族氨基酸转移酶，它的表达易受到氨基酸合成代谢的影响；Aro9p则是一种诱导表达蛋白，其表达受到氮源调控以及ARO8基因缺失等因素的影响。在已有研究中发现，虽然L-蛋氨酸不是芳香族氨基酸，但其代谢过程与芳香族氨基酸相似，基因ARO8和ARO9在利用L-蛋氨酸合成3-甲硫基丙醇中起到重要的作用[42-43]。Aro8p和Aro9p都具有广泛的底物特异性，其表达水平在以L-蛋氨酸为唯一氮源、葡萄糖受限的条件下较高，Aro8p表现出较强的催化蛋氨酸转氨基生物活性[2，43-44]。URRESTARAZU A等[43]研究表明，单独缺失ARO8或ARO9基因的酿酒酵母都能在含有蛋氨酸存在的基础培养基上生长，而同时缺失ARO8和ARO9基因后则无法生长，通过体外实验发现，ARO8基因编码的芳香族氨基酸转移酶I不仅对芳香族氨基酸具有转氨作用，而且还对蛋氨酸、α-氨基乙二酸和亮氨酸具有转氨活性，ARO9基因编码的芳香族氨基酸转移酶II同样具有较宽广的底物特异性。YIN S等[27]研究发现，过表达ARO8基因提高的芳香族氨基酸转移酶活性明显高于过表达ARO9基因所获得的活性，表明相比芳香族氨基酸转移酶II，芳香族氨基酸转移酶I在转化L-蛋氨酸合成3-甲硫基丙醇中效果更为明显。DEED R C等[25]研究表明，单独缺失基因ARO8可使酿酒酵母BY4743合成3-甲硫基丙醇的能力下降44%，使商用葡萄酒酵母F15合成3-甲硫基丙醇的能力降低92%；单独缺失ARO9基因对酿酒酵母BY4743合成3-甲硫基丙醇没有影响，然而却使菌株F15的3-甲硫基丙醇含量相比野生型菌株提高了46%。另外，相关研究还表明，转氨酶的转氨作用具有可逆性，Aro8p和Aro9p可以催化α-KMBA发生转氨作用产生L-蛋氨酸[45-46]。综上可见，酵母通过Ehrlich途径合成3-甲硫基丙醇中转氨酶Aro8p所发挥的转氨作用最为重要。

3.2 脱羧酶

在转氨酶的作用下，L-蛋氨酸转化为α-KM BA，α-KMBA则在脱羧酶作用下生成3-甲硫基丙醛，这种醛也具有独特的肉香味，对番茄、奶酪和酱油呈味也发挥重要的作用[47-48]。脱羧酶与转氨酶不同，在Ehrlich途径中是不可逆的[2]。VURALHAN Z等[48-49]研究了酿酒酵母CEN.PK113-7D中的脱羧酶，结果表明其拥有5个候选基因可以编码：ARO10（YDR380w）、THI3（YDL080c）、PDC1（YLR044c）、PDC5（YLR134w）和PDC6（YGR087c），表达的脱羧酶属于硫胺二磷酸依赖性脱羧酶[27]。ARO10基因编码的脱羧酶具有广泛的底物特异性，尤其对芳香族氨基酸具有很强的转氨活性，是产生支链和含硫杂醇类的关键贡献者，尚未发现THI3编码具有活性的脱羧酶，PDC1基因和PDC5基因编码为丙酮酸脱羧酶，与ARO10基因编码的脱羧酶类似，对所有支链和含硫的2-oxo酸均表现出活性，两者中一种的缺失都会激发另一种的大量表达，而PDC6仅能在含低硫的条件下表达，并且PDC5基因编码的脱羧酶脱羧效率与PDC1基因编码的相当，而PDC6基因编码的脱羧酶的脱羧效率最低[50-52]。

VURALHAN Z等[48]研究发现，在以苯丙氨酸、亮氨酸或蛋氨酸为唯一氮源时，5种脱羧酶基因中只有ARO10基因转录水平上调，其中使用L-Met作为唯一氮源时，ARO10基因的转录水平上调15倍，当其他四个基因失活时，ARO10能编码足够量的苯丙酮酸脱羧酶活性[49]。PERPETE P等[35]研究发现，KMBA在Ydr380wp作用下可脱羧生成3-甲硫基丙醛，若Ydr380wp失活，酿酒酵母不能将L-蛋氨酸转化为3-甲硫基丙醇，而缺失其他四个脱羧酶仍能转化3-甲硫基丙醇，由此推测KMBA的脱羧作用受Ydr380wp特异性影响。LIU B等[21]研究发现，盐度可以提高鲁氏接合酵母中ARO10基因的表达，从而增加其合成3-甲硫基丙醇的含量。YIN S等[27]通过基因过表达研究同样发现，ARO10基因的过表达可显著提高细胞脱羧酶活性，从而提高了3-甲硫基丙醇的产量。由此可见，5种脱羧酶中，ARO10基因所编码的脱羧酶对酵母通过Ehrlich途径合成3-甲硫基丙醇更为重要。

3.3 醇脱氢酶

在Ehrlich途径中，3-甲硫基丙醇合成的最后一步是氧化还原反应，其由3-甲硫基丙醛在醇脱氢酶的作用下发生还原反应而生成的，这一步是非限制性速度，不限制3-甲硫基丙醇的转化速度，因为酵母中存在许多乙酸脱氢酶，可被其中的任何一种催化完成[2]。

BOER V M等[53]研究发现，醛的氧化或还原受培养条件的影响，在葡萄糖限制型的恒化培养基中，当进行有氧发酵时大部分醛被氧化为酸，进行无氧发酵时大部分醛被还原为醇。VALLET A等[54]研究表明，仅有的能合成3-甲硫基丙醇细菌-酒类酒球菌IOEB 8406中存在乙醇脱氢酶（ADH）活性，在3-甲硫基丙醇的合成中起到重要的作用。DICKINSON J R等[55]采用13C核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析发现，醇脱氢酶Adh1p、Adh2p、Adh3p、Adh4p、Adh5p和Sfa1p中的任何一种都能将醛转化成3-甲硫基丙醇。然而，CHE Y X等[31]分析了在添加3-甲硫基丙醛的条件下酵母中7个ADH基因的表达情况，结果发现，只有ADH4表达量明显增加，在酿酒酵母S288c中过表达ADH4后，3-甲硫基丙醇产量明显增加，这表明不同醇脱氢酶在合成3-甲硫基丙醇中的重要性不同，有待进一步研究。

3.4 脱甲硫基酶

在Ehrlich途径中，L-蛋氨酸或其衍生物α-KMBA可以通过脱甲基化转化，从而产生甲硫醇（methanthiol，MTL），从而对3-甲硫基丙醇的合成产生影响，具有脱甲硫基功能的酶有胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CGL）和胱硫醚-β-裂解酶（cystathionine β-lyase，CBL）等[35]。KNOLL C等[56]研究发现酒类酒球菌中胱硫醚-γ/β-裂解酶似乎参与了蛋氨酸代谢途径生成甲硫醇，在过表达胱硫醚-γ-裂解酶基因的菌株中，显著增加了蛋氨酸的分解，产生了更多的甲硫醇。JIA K Z等[57]研究发现胱氨酸-β-裂解酶（CBL）可以将蛋氨酸和KMBA降解为甲硫醇，是合成甲硫醇的限速酶。然而，刘丽等[30]敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因后，酿酒酵母S288c所产3-甲硫基丙醇产量降低，推测可能除了胱硫醚-γ-裂解酶外，还有其他酶参与了L-蛋氨酸的去甲基化。ZHANG Q等[58]在粉红螺旋聚孢霉和酿酒酵母中过表达E3-泛素-蛋白连接酶HUWE1后显著提高了去甲基硫醇途径中甲硫醇及其衍生物的生物合成，而抑制了Ehrlich途径中的3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇的生物合成。由此可见，影响Ehrlich途径的支路上的酶对于3-甲硫基丙醇合成也具有重要影响。

4 展望

3-甲硫基丙醇是许多食品中的重要风味物质，随着人们对天然添加剂3-甲硫基丙醇需求的增加，微生物转化法生产3-甲硫基丙醇成为满足消费者需求的重要方法。但已报道的天然菌株中具有高产3-甲硫基丙醇的菌株较少，需要进一步筛选高产产3-甲硫基丙醇的天然菌株，另外，可以利用基因工程对天然菌株进行改造，如可以通过过表达Ehrlich途径中的关键酶，也可以敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因，减少蛋氨酸的支路代谢，从而提高3-甲硫基丙醇的产量，再次，也可以通过在发酵过程中分离出发酵产物3-甲硫基丙醇以减少其对微生物的毒性，从而连续不断的转化生成3-甲硫基丙醇。随着对微生物研究的深入，也可利用微生物群落法对不同的微生物进行最佳组合从而获得3-甲硫基丙醇的最大产量。由此可见，通过传统筛选方法、分子生物技术及发酵技术等组合可以实现生物法高效转化合成3-甲硫基丙醇，为生物法合成天然的3-甲硫基丙醇提供广阔的应用空间。