电化学发光免疫传感器研究进展

毛 俐,袁 若,杨 霞,袁世蓉,廖玉红,牛 欢,刘慧静,曹雅玲,甘贤雪

（1.西南大学化学化工学院，发光与实时分析教育部重点实验室，重庆400715)(2.西华师范大学化学化工学院，化学合成与污染控制四川省重点实验室，四川南充637002）

0 引言

电致化学发光 (Electrogenerated chemiluminescence)，也称电化学发光(Electrochemiluminescence)，简称ECL，是通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流，电极氧化还原产物之间或电极氧化还原产物与体系其它共存物质之间发生化学反应并生成某种不稳定的中间态物质，该物质分解而产生的化学发光现象。电致化学发光技术是电化学与化学发光相结合的检测技术，该技术既集成了发光与电化学分析技术的优点，又具有二者结合产生的可控性、选择性、重现性好、灵敏度高、检测限低及动力学响应范围宽等新优势[1～3]。

电致化学发光免疫传感器是一种将电致化学发光技术与免疫学分析方法相结合而发展起来的具有高灵敏度、高选择性、低背景等特点的生物传感器。其以免疫抗原抗体生物分子作为识别元件，通过固定化技术将免疫蛋白结合到感受器(电极)表面，当抗体分子超变区与抗原决定簇发生特异的免疫识别反应后，生成的免疫复合物与产生的电致化学发光信号相关联，由换能器转化这些与待测分析物浓度(或活度)相关的信号，再通过二次仪表放大输出，从而实现对待测免疫分子的定量检测。20世纪70年代之前，有关ECL免疫传感器的研究发展缓慢。80年代以后，大量有机化合物、无机化合物甚至半导体纳米材料等新型电致化学发光活性物质被合成。寻找新的高量子产率电致化学发光试剂或修饰这些发光试剂分子以用于生物分子标记成为合成并研究这些新型发光试剂的源动力[2～3]。近代临床医学对疾病标志物免疫分子快速、灵敏的检测要求，极大的推动了信号放大型的电致化学发光免疫传感器的研究。且随着生物技术和纳米材料技术的迅速发展，利用化学、材料及生物等多种技术特异性地转化并放大与免疫反应有关的检测信号，成为电致化学发光免疫传感器的重要研究方向。

1 电致化学发光主要发光体系

电致化学发光体系归纳起来主要分为三大类：无机化合物发光体系，有机化合物发光体系和半导体纳米材料发光体系。

1.1 无机金属配合物电致化学发光体系

很多无机金属的配合物和团簇分子都显示出做为ECL发光体必需的电化学和光学性质，其中 包 括 Ag、Al、Au、Cd、Cr、Cu、Eu、Hg、Ir、Mo、W、Os、Pd、Pt、Re、Ru、Si、Tb、Tl等[3]。 Ru(bpy)32+及其衍生物由于具有发光效率高、在室温的水或非水溶剂中稳定性好及在较低电位下单电子转移过程可逆等光化学和电化学优点，在电致化学发光体系及生物分析中的研究最为广泛[4～6]。

1.2 有机化合物电致化学发光体系

有机化合物的电致化学发光反应体系主要有三大类：(1)以9,10-二苯基蒽(DPA)及光泽精(DMBADN)为代表的稠环芳烃类(PAHs)化合物体系；(2)以鲁米诺为代表的酰肼类化合物体系；(3)以三键桥联喹啉或异喹啉的电子接受体和芳环的电子给予体为代表的电子给体－受体型化合物体系。以苯蒽和氮蒽(吖啶)为代表的稠环芳烃类化合物水溶性差，其电致化学发光反应要求在除氧和除杂的非水介质如：乙氰、四氢呋喃等中进行，其机理是通过在质子惰性的溶剂中自由基湮灭产生电致化学发光，所以该类型反应在分析应用尤其是生物分子分析上受到很大限制[2]。近年来，仅有以光泽精(N,N'-二甲基-9,9-双)为代表的吖啶酯类化合物在过氧化氢存在下也表现出了ECL活性，并被用于检测核黄素、人绒毛膜促性腺激素及卟啉铁等[7～10]。酰肼类电致化学发光化合物以鲁米诺(Luminol)及其衍生物为代表，具有发光效率高、试剂稳定及反应可在水相中进行等特点，其ECL机理研究已十分成熟。Luminol发光需在碱性条件下且有共反应物H2O2存在时才能进行[11]。由于H2O2和溶解氧都能增强Luminol的ECL信号，又是生物体内许多底物(如葡萄糖、胆碱和乳酸等)及其相应酶的代谢产物，因此Luminol-H2O2体系的酶促ECL反应是分析检测生物酶反应底物的有效方法[12～14]。电子给体－受体型化合物由于水相发光不稳定而极少用于生物分析中。

1.3 半导体纳米材料发光体系

半导体纳米材料(NPs)，也称纳米晶或量子点(quantum dots,QDs)。2002年首次报道了SiNPs在乙腈溶液中的自身湮灭发光和与共反应试剂C2O42-、S2O82-的电致化学发光[15]。除了单一元素半导体材料，如：Si和Ge具有电致化学发光性质之外，许多半导体化合物，如：CdS、CdSe和 CdTe也可以产生电致化学发光。半导体纳米颗粒修饰层固相ECL的研究还包括PbSe[16]、分子有机相中的单层 CdSe[17]、CdSe/ZnS[18]、 ZnS/CdSe 及 CdSe/CdS的核壳型修饰层[19]。因为半导体的纳米颗粒可以应用在光电子系统或作为未来纳米电子设备的一部分，所以这些半导体纳米颗粒固相修饰层的ECL研究对生物传感器构建极为重要。

2 电致化学发光体系在免疫传感器中的应用

将免疫分析法与高灵敏的传感技术相结合构建快速、灵敏、选择性高、操作简便的免疫传感器，可使抗体或抗原固定在固体基质上，通过异相反应从复杂组分中富集抗原或抗体，让固定化的免疫敏感膜发生信号变化，达到检测特定抗原或抗体的目的。近年来，利用电致化学发光的高灵敏、高特异及操作简单等优势，构建免疫传感器成为当前研究的热点课题之一。在众多电致化学发光体系中，仅有少数在水相中有较高量子产率且发光稳定的发光试剂，如：联吡啶钌及其衍生物，鲁米诺(Luminol)，量子点(QDs)等，被用做生物探针用于免疫传感器构建。

2.1 基于Ru(bpy)32+及其衍生物的ECL免疫传感器

联吡啶钌及其衍生物的电致化学发光免疫传感器是第一个用于商业应用的ECL免疫传感器。由于激发态Ru(bpy)32+*在近电极表面可发射一个光量子而生成基态Ru(bpy)32+，因此一个Ru(bpy)32+分子可参与多个ECL反应循环，从而产生多个光量子增加灵敏度并降低检测限。Ru(bpy)32+/TPrA是这类ECL免疫传感器中最常用的发光体系。鉴于联吡啶钌及其衍生物水溶性好，分子结构无官能团可共价交联而难于固载的特点，磁头固载一抗，Ru信号物标记二抗的夹心免疫检测模式，是该类传感器在商业检测中的主要模式[20]。衍生物Ru(bpy)32+-N羟基琥珀酸胺酯(NHS)共价交联或聚苯乙烯微球吸附Ru(bpy)32+是这类模式中标记二抗的主要方式[21～23]。通过磁性微头固载抗体结合抗原，最后夹心式固相结合已标记信号物的二抗以分离并冲洗掉未标记的ECL信号物，可实现低非特异性吸附的ECL免疫检测。与肿瘤、生育激素、甲状腺功能、心脏功能、肝炎、骨髓、老年痴呆、贫血病、糖尿病及传染病等相关的标志物检测，是应用该类ECL免疫传感器较为活跃的研究领域[24～27]。近年来，用ECL发光剂标记二抗进行相关免疫分析列于表1中。

为进一步在传感器界面特异性放大与免疫反应相关的电致化学发光信号，纳米材料、酶催化、生物放大等技术先后应用到基于联吡啶钌及其衍生物的电致化学发光免疫传感器中。Zhou和Roovers[40]设计合成了树枝状的联吡啶钌衍生物标记抗体，以提高ECL信号分子标记量，减少标记位点，该方法有效避免了多位点标记引起的蛋白失活，在检测信号上有明显提高。Miao和Bard[41]及汪尔康研究组[42]分别将生物素/亲和素多位点耦联应用到以Ru-NHS为二抗标记物的电致化学发光免疫传感器中，利用生物放大技术增加免疫结合信号标记物数量，实现ECL免疫检测信号的特异性放大。Yin等[43]用共反应试剂4-二甲基胺丁酸(DMBA)标记BSA和anti-IgG抗体分子制备夹心式免疫传感器，通过生物素/亲和素定向连接和纳米金颗粒放大一抗固载量，以提高免疫结合共反应试剂标记物DMBA的数量，增强传感器在1 mmol/L的Ru(bpy)32+底液中的ECL响应，其灵敏度比同类型免疫传感器提高了6～10倍。Deiss等[22]将生物素/亲和素定向标记联吡啶钌于二抗构建的电致化学发光免疫传感器与电子显微镜技术结合可进一步实现电致化学发光的可视化免疫分析。

表1 分析物浓度与ECL发光标记物相关的免疫测定Tab.1 Assays That Relate Emitter to Analyte Concentration

随着纳米材料技术的发展，越来越多的研究者将纳米标记技术应用到电致化学发光免疫传感器中。如：由油水微乳相法合成的SiO2纳米颗粒(SiNPs)是典型的油包水结构，其内层可包埋大量水溶性Ru(bpy)32+分子，外表面则含有带负电荷的羟基，可与蛋白分子上的羧基酯化交联用于固载或标记生物分子。汪尔康研究组[44]首先合成了联吡啶钌掺杂SiO2包裹多壁碳纳米管(Ru(bpy)32+-doped SiO2@MWNTs)的管状复合纳米材料，用于固载联吡啶钌，表现出很好的稳定性。随后，用油水微乳相法合成出SiO2包埋联吡啶钌(SiRu)的球形纳米颗粒[45]，通过层层自组装修饰生物分子到该纳米颗粒表面并研究其表面ECL性质变化。刘松琴课题组[46]与袁若研究小组[47～48]先后将这一SiRu纳米颗粒用做标记材料标记二抗构建ECL免疫传感器，用于检测不同的抗原AFP和小鼠IgG。与单分子标记相比，SiRu纳米颗粒可包埋大量Ru(bpy)32+标记于二抗分子上，因而放大了ECL响应信号。此外，利用纳米材料表面掺杂也可结合联吡啶钌及其衍生物，从而放大信号物标记量。Sun等[49]通过在负电荷的Pt纳米溶胶中滴加正电荷联吡啶钌，利用静电结合使纳米溶胶沉降并将联吡啶钌吸附在Pt纳米材料上(Pt@Ru)以固载联吡啶钌，取得较好的效果。袁若课题组[50～51]随后将这一Pt@Ru纳米颗粒用于构建固相电致化学发光免疫传感器，分别通过直接法和夹心法先后实现对AFP及人IgG抗原的定量检测。

脂质体是由磷脂双分子层组成的，内部为水相的密闭双分子单层或多层囊泡。其合成粒径可控，脂质体膜内水相可包埋或吸附大量信号物质或其它生物识别分子。将脂质体引入免疫传感器，可以放大免疫反应信号，提高免疫分析灵敏度，有效避免非特异性吸附干扰，增强免疫反应的选择性。Zhan和Bard[52]将联吡啶钌的衍生物包裹在粒径为100 nm左右的脂质体中用于标记二抗，通过夹心免疫反应结合到电极表面后，直接将联吡啶钌释放到含共反应试剂的底液中检测，从而实现人C反应蛋白的定量测定。Egashira等[53]用免疫脂质体包裹联吡啶钌结合到传感器表面后，再溶胞释放加热收集用于检测。脂质体增加了标记到二抗的联吡啶钌分子数量，特异性放大了免疫分析信号。袁若课题组[54]随后将这一免疫脂质体技术与适配体识别小分子技术相结合，利用脂质体包埋并放大可卡因小分子数量构建免疫检测平台，溶胞释放小分子后用适配体特异性收集结合可卡因小分子到近电极表面增强联吡啶钌的ECL信号，通过检测小分子可卡因浓度，间接实现对抗原浓度的测定。该方法通过脂质体包埋和适配体近电极表面键合共反应剂底物实现了ECL检测信号的多级放大，增强了检测的特异性，对心衰标志物NT-proBNP检测，其检测限可达 0.77 pg/mL。

酶催化用于联吡啶钌类免疫传感器的研究相对较少，Zhang等[55]利用乙醇脱氢酶(ADH)催化乙醇与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)反应生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH可与联吡啶钌的氧化态反应生成激发态，因而可增强联吡啶钌发光，用于对乙醇小分子的检测。袁若课题组Liao等[56]发展了由抗坏血酸酯在碱性磷酸酶的催化作用下在电极表面原位生成抗坏血酸增强联吡啶钌发光的反应，构建电致化学发光适体传感器用于凝血酶蛋白的测定，检出限为0.33 fmol/L，达到了超痕量级。

2.2 基于Luminol及其衍生物的ECL免疫传感器

Luminol及其衍生物的分子结构上有氨基等官能团，其既易于固载，又易于与蛋白分子的羧基共价交联而标记到抗原抗体等免疫蛋白分子上，所以基于Luminol及其衍生物发光的ECL免疫传感器研究成为ECL免疫传感器中的一个重要分支。

基于Luminol电化学发光的免疫分析最初采用均相电化学发光免疫分析法。1998年，Marquette和Blum[57]报道了将除草剂2,4-二氯苯氧基乙酸 (2,4-D)固载在玻碳电极表面，以Luminol为发光标记物标记anti-2,4-D抗体，竞争免疫结合于电极表面后，在流动注射(FIA)系统中通过H2O2放大抗体上的Luminol的ECL信号并进行检测，从而测定2,4-D浓度。随后，张成孝课题组[58]将小分子鲁米诺标记在小分子地高辛半抗原上，建立了地高辛抗体和地高辛的均相电化学发光免疫分析，克服了小分子电化学发光标记物标记在大分子抗体或抗原后发光效率严重降低的问题。其后，又将电化学发光标记物和小分子半抗原地高辛标记在载体大分子蛋白质上，建立了多标记均相电化学发光免疫分析法[59]。利用直接法测定地高辛标记抗体，竞争免疫法测定小分子半抗原地高辛[60]。

此外，还有许多的研究集中在Luminol及其衍生物类的固相电致化学发光免疫传感器方面。1999年，Arai等[61]报道了Luminol的衍生物 N-丁基胺-N-乙基鲁米诺(ABEI)为ECL标记物标记anti-hIgG，以碳纤维电极为敏感界面，在含H2O2的FIA系统中，检测hIgG的ECL免疫传感器。张成孝课题组[62]将ABEI标记抗体检测hIgG的ECL免疫检测方法发展到纳米金颗粒修饰的石蜡灌注石墨电极表面，制备固相ECL传感器直接在底液中检测，简化了装置，并用纳米颗粒进一步放大信号，降低了检测限。陈国南等[63]合成新型的钛酸盐纳米管用以固载胆碱氧化酶，利用胆碱在胆碱氧化酶作用下生成H2O2催化均相鲁米诺底液的电致化学发光，从而实现对样品中生物分子胆碱浓度的测定。

2.3 基于量子点的ECL免疫传感器

由于量子点表面可通过配位连接或聚合物修饰等方式包覆上有机分子或生物大分子，所以量子点(QDs)常做为生物探针应用到酶、抗原抗体、小分子键合蛋白和适配体的生物传感器中[64]。从2004年鞠熀先研究小组[65]首次构建出量子点ECL传感器并成功地用于H2O2检测以来，基于QDs的ECL传感器以其灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、操作方便、分析快速等优势，成为电分析化学中一个十分活跃的研究领域。

量子点的ECL性质受颗粒表面状态影响较大，利用生物蛋白分子在表面包覆会导致量子点ECL淬灭，研究者构建了一系列直接型的ECL免疫传感器。其原理是将量子点通过静电结合或共价连接等方式固载在电极表面，修饰上抗体后，利用抗原抗体免疫复合物阻碍固相中量子点与底液中共反应试剂S2O82-的反应，从而使量子点ECL淬灭，ECL淬灭程度与免疫结合上的抗原浓度相关。朱俊杰、陈洪渊研究小组[66]将半胱氨酸接枝的CdS固载在纳米金颗粒覆盖的电极表面，通过半胱氨酸共价结合抗体apoB-100，直接检测抗原，其检测限达6 pg/mL。用同样的方法固载CdSe量子点[67]，并用于人血清蛋白(PAB)检测，其检测限达0.01 ng/mL。在随后的研究中，他们用不同的方法掺杂碳纳米管(CNTs)于固相固载的量子点CdSe薄膜中，以增强量子点的ECL强度，提高蛋白检测的灵敏度。如：用壳聚糖分散的碳纳米管(CNT-CHIT)吸附CdSe量子点固载于金电极表面，通过3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)用戊二醛共价交联抗体anti-IgG，构建ECL免疫传感器用于检测人IgG，检测限达1 pg/mL[68]；用聚甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)正电荷化CNT-CdSe，结合纳米金，再结合抗体，通过PDDA和nanoAu对CdSe量子点ECL的双重增强作用放大信号提高检测灵敏度[69]。此外，张书圣等[70]将以上方法综合，用PDDA将CNTs正电荷化后，利用静电作用结合负电荷CdS量子点，以连接壳聚糖包裹的纳米金，固载抗体，检测抗原。

除了基于量子点的阴极发光检测外，近来鞠熀先等[71]还提出了一种在+0.90 V电位下(vs Ag/AgCl)下基于激发态QDs的阳极ECL被酪氨酸的电致氧化产物淬灭的检测方法。该方法旨在引入催化剂来加快传感器ECL反应速率，达到更快、更灵敏的检测效果。该传感器能在较低的阳极电势下通过结合微量酪氨酸酶催化循环反应来加速氧化产物产生和能量转移过程，极灵敏地检测较宽浓度范围内的酪氨酸，将检测限提高到了亚皮摩尔(subpicomolar)水平。

2.4 基于S2O82－的ECL免疫传感器

S2O82-是ECL体系中常用的共反应剂之一，通常与发光试剂共反应增强光信号。但是，Kovalc＇huk的工作小组发现了S2O82-水溶液在镁、银和铂电极表面有ECL现象，并且提出其可能机理为S2O82-被电化学还原为SO4-，当水溶液与SO4-这一强氧化态的中间体反应后产生发光物质，包括1O2和3O2[72]。到目前为止有大量的关于S2O82-水溶液ECL机理的研究，而将其用于生物分子检测的报道十分少见。问题的关键在于找到一种有效增强S2O82-水溶液阴极发光的方法，以放大信号构建传感器用于生物分子测定。袁若课题组[73]利用半胱氨酸对S2O82-发光的增强作用，首次构建了基于S2O82-阴极电致化学发光的无标记型免疫传感器，用于甲胎蛋白的检测，为高灵敏的ECL免疫分析开辟一片新领域。

3 展望

电致化学发光免疫传感器经过近三十年的发展，在新体系探索、信号放大、实际分析应用及与其它技术的结合等方面都取得了很大的进展。今后几年内电致化学发光免疫传感器的研究可能围绕以下几方面展开：(1)新的高效发光试剂的开发及在免疫传感器中的应用。尤其是半导体纳米材料类发光试剂的研究，由于半导体纳米颗粒可应用在光电子系统或作为微型电子设备的一部分，其可为免疫传感器的集成化、微型化打下坚实的基础，与微流控芯片分析结合将会在临床疾病标志物实时快速分析领域拥有广阔的应用前景;(2)多通道电致化学发光免疫传感器研究。电致化学发光拥有很宽的电压检测范围，且不同物质有不同的发光电压，很容易实现两种及其以上信号物ECL信号的同时检测，这对于构建多组分同时检测的免疫传感器极为有利。同时询证医学的发展必然会进一步推动这一ECL多组分免疫分析的研究;(3)电致化学发光与可视化分析技术(如：电子显微镜等)结合实现免疫检测的可视化分析。电致化学发光集成了电化学可控和光学可视的特性，电致化学发光分析仪与可视化装置结合对生物分子进行检测，将对分子水平的生物研究起到极大的推动作用。

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