纳米二氧化硅颗粒免疫凝聚用于霍乱毒素的检测研究

余红伟，王源升,2*，李 瑜，蒋健晖,吴海龙,魏 徴，沈国励，俞汝勤

（1.海军工程大学理学院化学与材料系，湖北武汉430033）

（2.四川大学高分子材料科学工程国家重点实验室，四川成都610065）（3.湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南长沙410082）

0 引言

胶乳凝集试验方法（LAT）是将抗体结合到胶乳微粒（直径约1.0 μm）表面，通过抗体识别相应抗原的特异性凝集反应，实现了对目标抗原的灵敏检测[1]，LAT具有简单、轻便、快速、选择性高等优点。1990年，Kurosawa等[2]首次将胶乳凝集法应用于压电传感检测领域，提出了一种胶乳型压电免疫检测方法（LPEIA），利用压电晶体对胶乳免疫凝集反应引起溶液密度、粘度等非质量参数变化的灵敏响应进行检测。其后，人们利用这种非质量效应型压电传感分析模式检测了多种生化物质[3～7]。近年来，人们采用纳米或亚微米级颗粒取代传统微米级胶乳进行凝集试验的研究发展很快[7～9]。相对传统LAT而言，基于纳米或亚微米级颗粒的免疫凝集试验具有许多优点：颗粒的悬浮稳定性高、背景响应信号低、易于获得较低检测下限等[7～9]。特别是SiO2颗粒作为亲水型材料，比普通胶乳具有更高的密度、比表面积和物理化学稳定性，同时易于制备和进行功能化处理，从而用作生物活性物质的载体（标记体）进行生化检测具有许多优势。

李瑜等进行了一系列基于压电LAT技术结合SiO2纳米颗粒对目标物的检测研究[10～14]，该文以SiO2纳米颗粒替代传统胶乳微粒标记霍乱毒素抗体，根据压电免疫凝集传感原理建立了一种改进的LPEIA技术用于霍乱毒素的直接、快速的检测。实验中，将修饰好的探针浸入磷酸盐缓冲液中，接着加入霍乱毒素抗体标记的SiO2纳米颗粒。反应体系中SiO2纳米颗粒表面的霍乱毒素抗体与霍乱毒素发生免疫凝集反应，使得溶液的粘度发生变化。该实验先在晶振表面固定霍乱毒素抗体，再用BSA封闭金电极表面未结合抗体的位点，以有效地减少非特异性吸附，而且探针上修饰的抗体可以结合抗原-SiO2-抗体复合物。因此，该传感器的信号通过两个因素获得有效放大：一是溶液性质的变化包括密度和粘度；二是吸附在晶振表面的物质的质量变化。将压电检测的质量效应和溶液粘弹性的变化有效结合，很好的起到信号放大作用，实现了对目标物的直接、快速、灵敏的检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

正硅酸乙酯（TEOS）和曲拉通X-100（广东省汕头市西陇化工厂）；霍乱毒素 （Cholera Toxin from Vibrio cholerae）及其抗体 （Anti-Cholera Toxin antibody produced in rabbit）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）（Sigma-Aldrich 公司）；氨水（30%）、丙酮、乙醇、聚乙二醇（PEG，MW 6.0 kD）（天津天泰精细化工公司）；戊二醛（GLU）（Fluka试剂公司）；血清白蛋白（BSA）（北京鼎国生物制品有限公司）。

9 MHz、AT-切型双面镀金石英晶振(QCM)（北京晨星无线电设备厂）；压电分析仪(QCA922)（美国普林斯顿应用研究所）；磁力搅拌器(Model JB-2)（上海分析仪器厂）；CSS501型恒温箱（重庆实验装备厂）；TCL-16A型台式高速冷冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；透射电子显微镜(TEM，HITACHI-H800)（日本 HITACHI公司）；铜栅(No.50-230)（中国科学研究院北京科学仪器公司）；B220S-T型超声清洗器（上海必能信超声有限公司）。

1.2 实验过程

1.2.1 纳米二氧化硅颗粒的制备及标记

按文献[13]报道的通过氨水催化正硅酸乙酯（TEOS）水解制备SiO2颗粒，在此实验中所用到的玻璃器皿均先用王水浸泡再用超纯水清洗。压电免疫凝集过程通过将石英晶片浸于含缓冲溶液（PBS，pH7.4）的自制的反应池来测定。

具体流程如下：

制备二氧化硅颗粒：

①将15mL曲拉通X-100、60mL环己烷、15mL正己醇依次加入到250mL的三颈烧瓶中于室温下（25℃）剧烈搅拌反应15 min，搅拌器转速为400 r/min（下文中搅拌器均为此转速）。②加入4mL去离子水到三颈烧瓶中，室温下搅拌15 min。③加入2mL氨水（30%）到三颈烧瓶中，室温下搅拌15 min。④加入2mL正硅酸乙酯（TEOS）到三颈烧瓶中，于室温下搅拌24 h。⑤将制得的SiO2纳米颗粒悬混于丙酮进行离心分离，再采用乙醇和水进行超声洗涤和分离，以除去“油”和表面活性剂分子。透射电镜分析结果表明这样制出的SiO2纳米颗粒的粒径大约为50 nm（见图1）。

二氧化硅颗粒的氨基硅烷化及抗体标记：

①取一定量 (30 mg)SiO2颗粒悬混于10mL甲醇中，加入0.30mL APTES，超声分散15 min后，再于室温下搅拌反应12 h，离心分离；然后依次采用甲醇和PBS溶液(pH7.0)进行超声洗涤，再离心分离，即完成SiO2颗粒的氨基硅烷化。②取10mL氨基硅烷化的SiO2颗粒悬浊液，先超声分散15 min，再加入5.0mL 2.5%戊二醛，于室温下搅拌反应3 h，再离心分离，即完成颗粒的醛基化。③将醛基化的SiO2颗粒悬混于4.0mL PBS溶液，超声分散15 min后，加入1.0mL霍乱毒素抗体原液，于37℃下温育1 h，离心分离，即制得霍乱毒素抗体-SiO2颗粒。然后，将颗粒悬混于4.0mL PBS溶液中，加入1mL浓度为10 mg/mL的BSA，于室温下搅拌反应1.5 h，以封闭霍乱毒素抗体-SiO2颗粒表面非特异性结合 （醛基）位点，离心分离，最后以PBS溶液超声洗涤，并悬混于3.0mL PBS溶液，直接用于分析或于4℃下保存（一般可稳定2个月）。

图1 纳米二氧化硅的透射电镜图：(a)凝聚后的硅颗粒；(b)氨基硅烷化的硅颗粒Fig.1 TEM figures of silica nanoparticles:(a)agglutinated silica nanoparticles；(b)amine-derivatized silica nanoparticles

1.2.2 传感器金电极修饰

滴加30 μL滴度为900的霍乱毒素抗体溶液到洗净的压电探针表面，晶振的一面用O型橡胶圈和塑料片封闭，使之单面触液于37℃恒温槽中温育1 h后用去离子水将晶振表面洗净晾干，加30 μL浓度为10 mg/mL BSA溶液到压电探针表面，在37℃恒温槽下温育1 h以封闭其表面蛋白吸附位点，再以PBS溶液（pH7.4）洗涤后，晾干备用。

1.2.3 凝聚检测

将修饰好的压电传感探针安装于盛有一定体 积 的 PBS 溶 液 （pH6.7，1.5 mg/mL PEG，40 mmol/L NaCl）的检测池中。在缓慢搅拌下向反应池中注入一定量的霍乱毒素抗体-SiO2悬浊液，检测池中溶液的总体积为200 μL。待探针的响应频率达到稳定后，再加入不同浓度的霍乱毒素到反应池中。在免疫反应进行期间，频率响应数据均被记录，直到响应达到平衡。对压电石英晶振的响应性能的考察主要包括以下方面：探针表面修饰，分析介质的组成以及相应的控制实验。所有实验数据都重复三次以上，实验温度控制在25℃。

2 结果与讨论

在凝聚反应体系中，随着免疫反应的进行，免疫凝集物逐渐在溶液中形成。这些免疫凝集物不仅能改变吸附在晶振表面的质量负载，而且能同时改变体系溶液的密度及粘度。为了得到理想的频率响应，晶振表面必须通过修饰来消除非特异性吸附。非特异性吸附一般是由于血清成分与传感器表面之间的静电作用引起的[15]。Chen等[14]考察了多种界面修饰方案来降低由非特异性吸附而造成的背景干扰。晋晓勇等[12]也考察了不同的界面修饰对免疫凝聚的影响。研究结果表明，晶振表面用抗体和BSA封闭后可以有效地抑制探针表面的非特异性吸附。因此在该实验中，先在晶振表面修饰霍乱毒素抗体，再用BSA进行封闭。这样处理后，BSA作为封闭剂可以有效地降低非特异性吸附；霍乱毒素抗体修饰的传感界面可以特异性结合抗原-SiO2-抗体复合物，从而引起显著的频率响应。

2.1 分析介质优化

分析介质的优化对于提高免疫凝集分析的灵敏度和消除血清成分非特异性吸附非常重要。在该实验中，免疫凝集分析介质包括以下几个主要因素：pH值对凝集反应的影响；NaCl浓度对凝聚反应的影响；抗体标记的纳米二氧化硅颗粒的合适用量；一定量的PEG作为免疫凝集反应的促进剂。

由于免疫凝集过程与胶体的带电量及其性质密切相关，因而受环境pH条件的影响较大。图2(a)显示了溶液pH值对特异性凝集反应的影响。从图中可看出，在pH7.0溶液中，免疫凝集反应的响应频率达到峰值。表明中性条件有利于霍乱毒素抗体-SiO2颗粒免疫识别相应抗体，这可能因为中性pH值条件下，霍乱毒素抗体-SiO2颗粒间以及抗体与抗原间静电排斥力较小，从而有利于颗粒发生免疫凝集反应而且利于反应主体间保持凝集所需的合适库仑作用力[17]。因此，实验选择在pH7.0的PBS溶液中进行免疫凝集检测。

图2 分析介质的优化(a)不同pH值下晶振对2.5 μg/mL霍乱毒素的频率响应；(b)不同盐离子(NaCl)浓度下晶振对2.5 μg/mL霍乱毒素的频率响应，溶液的pH值为7.0；(c)压电探针表面检测池中抗体标记纳米二氧化硅的用量对霍乱毒素的频率响应；(d)PEG对凝聚反应的影响：Ⅰ为未使用PEG时压电探针对2.5 μg/mL霍乱毒素的实时频率响应，Ⅱ为使用PEG后压电探针的实时频率响应Fig.2 Optimization of the assay medium,the concentration of cholera toxin in the experiment is 2.5 μg/mL(a)pH dependence of the probe in pH(6.0～8.0);(b)ion-strength dependence of the probe in 10～90 mmol/L NaCl,the pH of the solution is 7.0;(c)frequency responses of the probe,where the volume of the CT antibody labeled silica nanoparticles in probe cell varied from 20 μL to 100 μL,the total volume of the solution in probe cell is 200 μL;(d)comparison of frequency response processes between without(Ⅰ)PEG and(Ⅱ)with PEG amplified immunoagglutinations

实验通过向缓冲溶液中加入不同浓度NaCl考察了离子强度对免疫凝集反应的影响。从图2(b)可看出，免疫凝集反应的响应频移值随着溶液中NaCl的浓度增加而增加，至NaCl浓度为30 mmol/L时达到峰值。当NaCl浓度超过30 mmol/L时，响应频移值即随其浓度的增加而递减。表明30 mmol/L NaCl为免疫凝集反应适宜的离子强度。适宜的NaCl浓度不仅有助于促进或加速免疫识别/凝集过程[17]，而且对非特异性凝集/吸附具有一定的抑制作用[5]。

实验通过加入不同用量的霍乱毒素抗体-SiO2颗粒于检测缓冲液中，检测池中溶液的总体积为200 μL。考察了颗粒用量对免疫凝集反应的影响。由图2(c)可知，霍乱毒素抗体-SiO2颗粒浓度对免疫凝集响应的影响明显，并当颗粒用量为70 μL时响应频移值最大。这是因为霍乱毒素抗体-SiO2颗粒浓度过低，引起的溶液密度和粘度变化小；而颗粒浓度过高则导致溶液中密度和粘度过大，免疫凝集反应的传质位阻增加，凝集反应的响应频移值随即下降[12]。

聚乙二醇 （PEG）是一种水溶性的聚合物，PEG作为凝集反应促进剂已被广泛用于胶乳型免疫凝集分析或作为沉淀剂用于不同种类物质的分离。实验中，通过加入PEG于检测缓冲溶液中，考察了PEG对霍乱毒素抗体-SiO2颗粒免疫凝集反应的促进作用。图2（d）比较了实验使用和未使用PEG进行免疫凝集反应时探针的频率响应结果。由图2(d)可知，PEG的应用大幅度地提高了凝集反应的响应频率值大小及其速率，PEG分子中含有大量醚键，可以很容易通过氢键与蛋白质分子绑定，从而降低了蛋白质分子与水分子之间的亲合力[15]。促进凝聚反应的进行，该实验中使用PEG的浓度参照文献[13]，检测介质中PEG的终浓度为1.5 mg/mL。

2.2 免疫凝聚检测霍乱毒素

在最优化的实验条件下 （检测溶液的pH值为 7.0、NaCl浓度为 30 mmol/L、200 μL 检测介质中抗体标记的纳米二氧化硅颗粒为70 μL、溶液中PEG的终浓度为1.5 mg/mL），检测了一系列不同浓度的霍乱毒素的频率响应值与浓度关系。图3为该传感器的频率变化值和不同浓度的霍乱毒素之间的校准曲线。如图3中的插图 所示，在霍乱毒素浓度为0.50～1.5 μg/mL的范围内，压电免疫传感器的频率变化值与霍乱毒素浓度成线性关系，相关系数为0.996。根据3σ规则估算出检测下限为 0.049 3 μg/mL。

图3 传感器对霍乱毒素的检测曲线，内插图 为线性范围的线性拟合，实验数据均是在最优化条件下获得，每一个点的数据都平行测定三次取平均值，误差棒所示为三次测定的标准偏差Fig.3 Calibration curve describing the relationship between the frequency responses and varying concentrations of cholera toxin under the optimized conditions.Inset:linear relationship between the frequency responses and the different cholera toxin concentration.Each data point represents the average of the frequency responses of triplicate measurements.The error bars are standard deviations

2.3 传感器的选择性实验

为了验证免疫凝集检测的选择性，该文进行了控制实验。实验过程和检测霍乱毒素相似，将修饰好的压电传感探针安装于盛有130 μL PBS溶液 （pH7.0，1.5 mg/mL PEG，30 mmol/L NaCl）的反应池中，在缓慢搅拌下向反应池中注入70 μL霍乱毒素抗体-SiO2悬浊液.待探针的响应频率达到稳定后，再加入含有一定量的BSA、HAS、羊IgG、兔IgG等干扰物的待测样品到反应池中。在免疫反应进行期间，频率响应数据均被记录，直到响应达到平衡。表1描述了该压电免疫凝集方法对不同检测物的试验结果。从表中可知，干扰物蛋白质引起的频率响应相对于霍乱毒素特异性凝集所引起的频率响应，可以忽略不计。

3 结论

该文系统研究了基于SiO2纳米颗粒免疫凝集的压电免疫传感器对霍乱毒素的直接检测。该压电免疫凝集检测体系拓展了LPEIA技术，发展了一种新的基于凝集反应的免疫检测方法。实验中，应用TEM考察并证实了SiO2标记的霍乱毒素抗体与相应抗原霍乱毒素的免疫凝集现象。所研制的霍乱毒素抗体修饰的且用BSA封闭的探针对样本具有更高的生物相容性与传感响应性能。这是由于探针的信号通过两个因素得到有效地放大—溶液性质的变化（密度及粘度）和晶振吸附的抗原－纳米颗粒－抗体复合物的质量变化。免疫凝集促进剂PEG及离子强度控制剂NaCl的使用显著提高了方法的检测灵敏度并降低了其敏感下限。该方法能够检测到霍乱毒素的最低浓度为 0.049 3 μg/mL。

表1 传感器探针对不同蛋白质的频率响应Tab.1 Frequency response to cholera toxin,BSA,Goat IgG,Rabbit IgG and HSA evaluated by the developed immunoagglutination system

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