单唾液酸四己糖神经节苷脂固体脂质纳米粒的制备方法及性质考查*

佟若菲，朱雪瑜

(1.天津市儿童医院，天津 300074； 2.天津药物研究院，天津300193)

单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside，GM1)是含唾液酸的糖神经鞘脂，是哺乳动物细胞膜的组成成分，对细胞的分化、生长、轴浆运输和再生均起到重要的生理作用。

目前，GM1在临床上已被广泛用于治疗各种创伤性和心脑血管疾病的神经损伤[1]及各种慢性病后期的神经功能障碍、脑萎缩、阿尔兹海默病、智力障碍[2,3]等。为提高GM1在体内的生物利用度，同时能够更快速地进入脑组织中，并且解决临床应用剂型的稳定性，从而更有效地治疗急慢性中枢神经损伤，现尝试将GM1制备成固体脂质纳米粒(SLN)，并可进一步开发粉针剂型，方便临床使用。

1 材料与仪器

GM1(自猪脑中提取，自产，纯度为95%)；大豆卵磷脂(四川英格尔公司，批号为20100306)；硬脂酸(浙江物美化学品有限公司，批号为20101024)；泊洛沙姆F-68(南京威尔化工有限公司, 批号为20100822)；硬脂酸聚烃氧酯S-40(辽宁奥克化学集团有限公司, 批号为20100917)；甘露醇(青岛明月海藻集团有限公司, 批号为360902001)；双蒸水(自制)；药用西林瓶[双峰格雷斯海姆医药玻璃(丹阳)有限公司]。以上原料及辅料均为药用级。搅拌加热套(型号HWCL-G)；旋转蒸发仪(型号R202-2A)；高压乳匀机(型号NS1001L)；冷冻干燥机(型号LGJ-25C)。

2 方法与结果

2.1溶剂乳化法 将10 mg GM1和100 mg硬脂酸溶于氯仿中，200 mg大豆卵磷脂溶于适量乙醇中，两部分混合即成有机相，水浴加热至75 ℃。将200 mg泊洛沙姆F-68溶于双蒸水，即为水相，该水相放在搅拌加热套上，加入磁子进行搅拌并加热至75 ℃，保持恒温。用胶头滴管将有机相逐滴加入水相中，恒温搅拌至形成透明体系。将该体系转入旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂，并浓缩至总体积的1/2。将浓缩液快速加入0℃水相中，快速搅拌降温2 h，形成GM1固体脂质纳米粒(GM1-SLN)的混悬液。

2.2高压乳匀法 称取50 mg硬脂酸、30 mg大豆卵磷脂，加热到75 ℃，充分搅拌混匀获得液态油相。称取10 mg GM1加入到液态油相中，充分搅拌至澄清均匀。称取250 mg硬脂酸聚烃氧酯S-40，加入50 ml双蒸水，置搅拌加热套上加热并恒温于75 ℃即为水相。用胶头滴管将75 ℃的含GM1的澄清溶液逐滴加入到水相中，同时采用磁子进行搅拌。混合均匀后采用高压乳匀机乳化5 min，冷却至室温即得GM1-SLN混悬液。

2.3注射用冻干粉针剂的制备 将经两种方法获得的GM1-SLN混悬液分别加入适量双蒸水，使体积为500 ml，加入一定质量的甘露醇使其终浓度为3%，分装于5 ml药用西林瓶中，置于冷冻干燥机中-40 ℃预冷，设定冻干程序，观察冻干过程中的状态，直到获得白色疏松状粉末。

2.4结果

2.4.1纳米粒外观及稳定性观察 制得的GM1-SLN为乳白色混悬液。取两种方法制备得到的GM1-SLN的混悬液样本各10份，其中5份放置于室温，另外5份放置于4 ℃冰箱内，放置24 h、1个月、3个月、6个月观察其外观，发现无外观变化；然后以4 000、5 000、10 000和15 000 r/min进行常温高速离心10 min，无沉淀和分层现象发生。

2.4.2纳米粒形态学考查[4]取两种方法制得的GM1-SLN混悬液适量，加双蒸水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以2%的磷钨酸钠液负染，在透射电镜下照片，见图1。照片显示，纳米粒呈类球形，分散状态良好，溶剂乳化法和高压乳匀法算术平均粒径分别为108和90 nm。

2.4.3纳米粒包封率考查 取两种方法制得的GM1-SLN混悬液适量置离心管中，100 000 r/min离心15 min，吸取上清，用蒸馏水补足体积，再次以100 000 r/min离心15 min，吸取上清。合并两次上清，用HPLC法测定其中GM1含量[5]计为M1；精密量取GM1-SLN 10 ml，置于50 ml量瓶中，加双蒸水定容至刻度，摇匀，超声后，3 500 r/min离心3 min，取上清液进样测定GM1含量计为M0。按下式计算溶剂乳化法和高压乳匀法包封率[6]分别为87.31%和95.28%，见表1。其中：包封率=(1-M1/M0)×100%。

溶剂乳化法 高压乳匀法

表1 两种不同方法的包封率比较(n=3)

2.4.4注射用冻干粉针剂性状 由溶剂乳化法制得的GM1固体脂质纳米粒经冻干后有明显分层显现，冻形不佳，且松散，极易破碎。经高压乳匀法制得的GM1固体脂质纳米粒经冻干后冻干粉呈均匀白色，且无分层显现，具备一定固体力度，且复溶性好。

3 讨论

GM1分子是由一个疏水的神经酰胺部分和亲水的唾液酸寡糖基团组成，分子量为1 574 D。GM1具有促进神经重构，加速神经细胞修复；促进神经再生，促进神经轴突生长和突触形成；恢复神经支配功能，改善神经传导，促进脑电活动及其他神经电生理指标的恢复；保护脑细胞膜，促进细胞膜各种酶活性恢复等功能。

外源性GM1具有脂溶性，试验证明进入体内后可以穿过血脑屏障，聚集于受损脑区，嵌入细胞膜内，模仿内源性GM1的功能发挥作用。外源性GM1一般从牛脑或猪脑中提取获得，临床目前应用的为进口注射水针剂型。虽然GM1可以进入脑组织，但是通过对GM1的药物动力学研究证明，外源性GM1注射到动物体内后，大量聚集在肝内，仅有20%进入脑、脊髓、肾脏等脏器，并且血清半衰期较短，进入体内的药物仅有少量发挥作用，使用效率低，在临床上为了达到治疗效果通常用量较大，因而有必要通过相应方法提高GM1的生物利用度。

SLN是近年正在发展的一种新型毫微粒类给药系统，是指以生物相容的高熔点脂质为骨架材料制成的纳米球，以固态的天然或合成类脂将药物包裹于类脂核中制成粒径为50～1 000 nm的固体胶粒给药体系。由于骨架材料在室温时是固体，故SLN既具有聚合物纳米球的物理稳定性高、药物泄漏少、缓释性好、性质稳定、制备简便的特点，又兼有脂质体毒性低、易于大规模生产的优点[7]。常用的高熔点脂质有饱和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂质等。SLN与以磷脂为主要成分的脂质体双分子层结构不同，是由多种类脂材料形成的固体颗粒，其同时具有一定的缓释作用，可以作为靶向定位和控释作用的载体。SLN为一种在药学领域展现出很好应用前景的药物载体，并且已经应用于临床。本实验分别采用溶剂乳化法和高压乳匀法制备GM1固体脂质纳米粒，并将制备结果进行比较。

通过以上两种方法比较，高压乳匀法较溶剂乳化法不仅收率、包封率高，且初步冻干粉性状亦更符合冻干粉针剂的药品标准要求，因而推测可作为GM1临床注射用冻干粉针剂的制备的方法。为获得临床生物利用度高，且能安全有效到达治疗位点的GM1临床剂型，下一步工作将针对高压乳匀法进行更深入的研究。

1 刘卫东，蒋万书，黄光富，等. 神经节苷脂 GM1对弥漫性轴索损伤疗效的临床观察.中国临床外科杂志，2002，7(6)：341

2 水涛，张国哲，张赛，等. GM1添加治疗重型颅脑创伤的临床观察. 中华神经外科疾病研究杂志，2004，3(1)：35

3 李昭杰，周东，舒航.单唾液酸四己糖神经节苷脂对急性颅脑损伤应用价值的临床观察.中国医院药学杂志，2001，21(7)：417

4 刘铁根，张凡，孟卓.纳米粒子大小及其分布检测方法的研究现状与发展.光学技术，2005，31(1)：96

5 刘勤，谢剑炜.单唾液酸四己糖神经节昔脂钠杂质检查及含量测定方法的研究.药物分析杂志，2005，25(2)：153

6 刘玉梅，朱昆，马海明.黄芩素固体脂质纳米粒包封率测定及体外释放度考查. 实用药物与临床，2009，12(2)：104

7 谢方明，曾抗，李国锋. 鬼臼毒素硬脂酸固体脂质纳米粒的制备.第一军医大学学报，2005，25(1)：99