滋肾方对痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响*

韩 琴，赵玉霞

(天津市海河医院，天津 300350)

随着社会人口老龄化，老年痴呆越来越引起人们的关注。其中老年性痴呆(Alzheimer’s disease， AD)是最常见的一种类型。AD的主要特征性病理学改变是大脑萎缩、脑组织内大量老年斑(senile plaque，SP)形成、大脑皮层和皮层下结构细胞内神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)及脑实质血管淀粉样变性[1，2]。已有实验结果证实，滋肾中药对老年性痴呆模型大鼠神经细胞具有保护作用[3-6]。推测可能与该组方抑制细胞凋亡有关。本实验通过建立D-半乳糖所致亚急性衰老合并鹅膏蕈氨酸化学损毁Meynert核(迈耐特核)所致接近老年痴呆症的痴呆复合动物模型，并观察滋肾方对痴呆大鼠行为学和学习记忆的影响，为抗老年痴呆新药滋肾方的开发以及进入临床试验阶段提供实验资料和科学依据。

1 试药与动物

滋肾方：由天门冬、山萸肉、熟地、龟板、黄精等中药组成，中药饮片由天津市海河医院中药房提供。健康Wistar雄性大鼠，鼠龄9～10周，体重300～350 g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物试验中心提供。鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid，IA)，SIGMA公司生产。氨基甲酸乙酯(urethane)，中国医药公司上海化学试剂公司生产。D-半乳糖(D-galactose)，FARCO CHEMICAL SUPPLIES。MG-2型迷宫，江苏省张家港市生物医学仪器厂制造。江湾Ⅰ型立体定位仪，上海花木农机厂制造。

2 方法与结果

2.1分组及模型的制备 将Wistar大鼠30只随机分为空白对照组、痴呆模型组和痴呆模型滋肾方组，每组10只。予痴呆模型组和痴呆模型滋肾方组大鼠腹腔注射10%D-半乳糖，50 mg/kg·d-1，予空白对照组大鼠腹腔注射等剂量的生理盐水，连续给药4周。将5 μg的鹅膏蕈氨酸溶于1 μl的0.2 mol/L 、pH 7.4磷酸缓冲液(NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O)中待用。将痴呆模型组、痴呆模型滋肾方组大鼠进行化学损毁Meynert基底核手术。方法为将上述两组大鼠经25%氨基甲酸乙酯(4 ml/kg)腹腔麻醉后，固定于江湾Ⅰ型立体定位仪上，剪去头部鼠毛，以碘酊和75%酒精常规消毒手术区皮肤，沿颅中线纵向切开约2～3 cm，剥开皮下筋膜暴露颅骨，用棉球分离骨膜，暴露出十字缝和人字缝。移动立体定位仪上下标尺，调整大鼠头部平面，使十字缝比人字缝宽1.5 mm。参照大鼠脑立体定位图谱[4]，按定位坐标AP 1.4 mm，ML 2.4 mm，DV 7.4 mm，钻开颅骨。用微量进样器在钻孔处垂直进针，然后以0.2 μl/min 的给药速度缓慢注入配好的IA溶液，持续给药5 min，留针5 min，以利于药液吸收，并防止扩散[8、9]。同样方法损毁另一侧Meynert核。术后用牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤。

2.2滋肾方的煎制及给药方法 将中药滋肾方各药材置于药锅内，加相当于药材质量7倍的冷蒸馏水，浸泡2 h，煮沸30 min，过滤。药渣加5倍量蒸馏水继续煎煮，煮沸20 min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成1 g/ml生药药液[7，8]。造模后7 d给予大鼠药物治疗，痴呆模型滋肾方组按生药5.2 g/kg·d-1，灌胃，连续给药20 d；空白对照组和痴呆模型组的大鼠给予等剂量的生理盐水。

2.3电迷路法测试大鼠学习记忆能力 大鼠学习记忆测定在Y型迷宫(Maze)箱中进行。该装置分成三等分，分别称之为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂。每臂长为30 cm、高为15 cm、宽为12 cm。箱底铺设直径为3 mm的铜栅，铜栅间距为7 mm，可通以脉冲电流，电压60 V，延迟时间为5 s，每臂顶端装有15 W信号灯，灯光示为安全区，不通电。如以Ⅰ臂为起步区，则Ⅱ臂为安全区，Ⅲ臂为电击区。训练时在安静的暗室中，让大鼠在暗室中适应30 min后开始训练[9]。将大鼠放入起步区适应3 min，操纵迷宫刺激器，按顺时针方向改变安全区方向给予灯光信号。在大鼠受电击后从起步区直接逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应。灯光持续亮15s后熄灯，结束一次训练，休息60 s。此时该安全区作为下一次训练的起步点，顺时针给予灯光刺激，待其逃避至安全区[10]。学习48 h后进行记忆测试。大鼠的学习记忆成绩以满分100分计算，每错一次减2.5分[11]。

2.4统计学处理 采用SPSS 11.0进行数据分析。药物治疗前后学习记忆成绩的比较采用配对t检验法。α=0.05，双侧检验。

2.5结果

造模后大鼠的学习成绩与记忆成绩均低于造模前，给予滋肾方后学习记忆成绩明显高于给药前，差别有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 滋肾方对痴呆模型大鼠学习和记忆成绩影响 分

3 讨论

AD作为老年人痴呆的一种特殊类型越来越受到人们的关注。祖国医学认为，肾与脑紧密相关，肾虚是衰老的基础，是许多老年性疾病发生的主要原因，若肾亏髓枯，脑失所养，则出现记忆、智能、精神等方面的障碍，进而影响全身的生理功能。针对AD肾精不足，气血亏虚，痰凝血瘀的病机，根据中医基本理论，经科学组方，提出了滋肾方。

本实验采用D-半乳糖所致亚急性衰老合并鹅膏蕈氨酸化学损毁Meynert核所致复合痴呆动物模型，观察和分析滋肾方对大鼠学习记忆能力的影响。

结果表明：造模后大鼠的学习成绩与记忆成绩均低于造模前，给予滋肾方煎剂灌胃治疗20 d后，行为学测试数据表明，中药滋肾方可明显改善痴呆大鼠的学习和记忆障碍，学习和记忆成绩明显提高，与治疗前比较差别有显著性，具有统计学意义(P<0.01)。

中药滋肾方作为一种新的治疗手段，其具有更为广阔的发展前景。

1 David M A Mann,田金洲,时晶,等.阿尔茨海默病患者脑淀粉样血管病变.中华老年医学杂志,2003,22(11):708

2 Cacabelos R. The application of functional genomics to Alzheimer’s disease. Pharmcaogenomics，2003,4(5):597

3 何明大,刘运林.脑灵汤对阿尔茨海默病模型鼠调亡调控基因的影响.中国现代医学杂志,2005,15(22):3398

4 Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Sydney: Academic Press, 1988：17

5 马涤辉,刘晓亮,张昱,等.实验性Alzheimer模型鼠脑组织5-羟色胺含量改变的研究.中风与神经疾病杂志,1996,13(3):150

6 李亚明,张春燕,林水淼.调心方对D-半乳糖合鹅膏蕈氨酸致痴呆大鼠学习记忆、脑磷酸化tau蛋白水平的影响.黑龙江中医药,2000,3:52.

7 李仪奎主编.中药药理实验.上海:上海科学技术出版社,1991:36,171

8 皮明钧,刘莺,陈力,等.加味温胆汤对亚急性衰老大鼠血GSH-Px及肝、脑MAO、LPF的影响.中国中医基础医学杂志,1999,5(2):14

9 尹兆宝,王健,杨新平,等.D-半乳糖诱导拟衰老动物模型的记忆行为改变.中国老年学杂志,2000,20(1),33

10 徐叔云,卞如濂,陈修主编.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社,2002:179-181,202-204,769-772,826

11 任汝静,陈生弟.阿尔茨海默病的治疗现状和展望.中国现代神经病学杂志,2005,5(3): 147