七味红花殊胜散对肝缺血再灌注损伤中caspase－3的影响

杨春燕 曹成珠 汪晓筠 朱艳媚 严云飞

青海大学医学院，青海 西宁 810001

肝病在藏区中被称作“赤巴病”，在藏医药的经典著作中赤巴病被列为三大疾病之首。由饮食、生活习惯、气候条件、经济落后、性格影响和遗传导致。七味红花殊胜散治疗肝病的主要机制是，活血化瘀改善肝脏微循环。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用健康SD大鼠，由青海省实验动物中心提供。大鼠抗Caspase－3多克隆抗体由SantaCruz公司生产;NO测试盒购于北京中山公司。

1.2 分组与取材方法

雄性大鼠40只随机分成4组。①正常对照组10只;②缺血组10只;③缺血再灌组10只;④七味红花殊胜散组10只。全麻下消除肝脏侧支循环，用Pringle法使肝缺血［1］，建立全肝缺血再灌注模型。对照组麻醉后仅行开腹手术，而不阻断入肝血流［2］。

1.3 Caspase－3免疫组织化学染色

采血后快速取出肝脏固定48h，①切片脱蜡至水，在PBS中摇洗;②3%甲醇－过氧化氢室温下孵育，蒸馏水清洗，PBS摇洗;③10%血清工作液封闭抗原，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育;④加入抗Caspase－3抗体，4℃冰箱过夜;⑤PBS摇洗，加入生物素化二抗IgG，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育;⑥PBS中摇洗，加入辣根酶标记液，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育;⑦PBS中摇洗，DAB显色，自来水充分冲洗，终止显色，中性树胶封片。每例动物随机选取5张切片于光学显微镜下进行观察。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 各组NO检测 (结果见表1)。

表1 各组大鼠血清NO含量的变化()

表1 各组大鼠血清NO含量的变化()

注:*与再灌注组相比，P＜0.01。

组别 n NO(μmol/L)正常对照组 10 19.82±0.71*缺血组 10 17.43±1.28*再灌组 10 12.36±0.12七味红花殊胜散组 10 16.51±1.49*

大鼠血清NO含量再灌组与正常组相比 (P＜0.05)，与七味红花殊胜散组相比 (P＜0.05)。

2.2 各组肝细胞凋亡率及caspase－3阳性细胞计数 (s)(结果见表2)。

表2 各组肝细胞凋亡率及caspase－3阳性细胞计数

表2 各组肝细胞凋亡率及caspase－3阳性细胞计数

注:*与再灌注组相比，P＜0.01。

组别 n 细胞凋亡率% caspase－3(number/mm2)正常对照组 10 3.58±1.52 6.02±1.20*缺血组 10 7.86±2.13 9.43±1.68*再灌组 10 6.15±1.98 8.36±0.96七味红花殊胜散组 10 4.51±2.09 6.21±1.49*

肝细胞凋亡率及caspase－3阳性细胞计数再灌组与正常组相比 (P＜0.05)，与七味红花殊胜散组相比 (P＜0.05)。

3 讨论

缺血再灌注肝损伤 (HIRI)是肝脏和创伤外科疾病中常见的病理过程，也是导致术后肝功能衰竭或肝移植早期无功能的主要原因之一。缺血再灌注损伤过程中肝脏及肝外脏器会出现一系列代谢、结构和功能的损伤，有时甚至引起肝功能衰竭及多器官功能衰竭。肝脏缺血再灌注损伤机制目前尚未完全阐明。近年来的研究表明，枯否氏细胞和中性粒细胞是引起肝缺血再灌注损伤的关键细胞，它们激活时释放出的外源性活性氧可致肝窦内皮细胞和肝实质细胞损伤，并增加黏附分子表达，致使血小板和中性粒细胞与血管内皮细胞黏附，引起了肝脏微循环的障碍。这将直接影响到疾病的预后、手术成功率和病人的存活率。因此，对于肝脏缺血再灌注作用机制的研究，具有重要的临床意义［3－4］。Caspase－3被认为是 Caspase家族介导细胞凋亡的最终执行者，本实验结果表明:肝缺血再灌注损伤时Caspase－3基因表达显著增强，说明缺血再灌注损伤产生的凋亡刺激信号激活了依赖于Caspase－3家族的细胞凋亡机制而诱导肝细胞凋亡，这与其他的相关报道基本一致［5］。

本实验结果显示:七味红花殊胜散对肝损伤的保护作用可能主要与其保护抗氧化酶的活性，提高机体的抗氧化能力有关;另外可引起细胞外Ca2+大量内流，胞浆Ca2+是凋亡的第二信使，它激活蛋白激酶C等，从而激活凋亡相关基因，诱导细胞进入凋亡通道［6］。促进蛋白质合成及解毒作用，减少了细胞损伤，并有促肝细胞再生、恢复肝功能的作用。

［1］袁林，杨建青，渚光平等.潘生丁对实验大鼠肝缺血再灌注损伤的影响［J］.腹部外科，2006，19(4):244－246.

［2］王永刚，叶启发，齐海智.潘生丁对大鼠移植肝缺血再灌注损伤保护作用的实验研究［J］.中华现代手术学杂志，2006，10(6):412－414.

［3］彭松林，顾玺，戴朝六，等.参附注射液对肝缺血再灌注大鼠血浆前列环素和血栓素A2及肝组织ATP酶的影响［J］.中西医结合学报，2007，5(4):427－431.

［4］王新良，王新颖，王佩薇等.一氧化氮在肾缺血再灌注损伤中的作用［J］.中国应用生理学杂志，2006，22(11):2142－2145.

［5］Chao FC，David W，Chie PH，et a1.The protective effect of niacinamide on ischemia－reperfusion－induced liver injury［J］.Biomedical Sci，2004，8:446－452..

［6］韩英，刘楠，陈荣华，等.大鼠脑缺血再灌注损伤后的细胞凋亡与Bcl－2、Bax的表达［J］.中国临床神经科学，2006，14(1):15～19.