复方蛹虫草制剂对慢性疲劳综合症小鼠的治疗作用

季锡中 宁 青 谈 唯 张润桐 贾晓斌

江苏省中医药研究院中药新型给药系统重点实验室/国家中医药管理局中药口服释药系统重点研究室，江苏 南京 210028

慢性疲劳综合征 (Chronic Fatigue Syndrome，CFS)是现代节奏紧张的生活方式下出现的一组以长期疲劳 (包括体力疲劳和脑力疲劳)为突出表现的全身性证候群，持续超过六个月，并伴有低热、咽痛、头痛、肌肉关节肿痛、抑郁、健忘、失眠或嗜睡等症状。活力降低，适应能力减退，机体各系统的生理功能和代谢免疫功能低下。CFS病人的临床症状主要有神经、内分泌、免疫三大系统的异常［1］，同时伴有认知功能受损。蛹虫草 (Cordyceps militaris(L.)Link)与冬虫夏草同属异种，系我国名贵传统滋补强身药材，人工培养较成功，有较大的经济价值。蛹虫草中的多糖类大极性分子是其提高机体免疫功能的有效组分［2，3］，具有抗感染、抗氧化以及免疫调节等生物学活性，提示多糖成分可能对CFS有效。本课题以poly I:C模拟病毒感染，建立小鼠CFS模型，在整体水平研究蛹虫草复方对CFS模型小鼠的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及材料

昆明种健康雄性小鼠，体重 (20±2)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXX(沪)2007－0005。血清皮质酮放免试剂盒 (北京普尔伟业生物科技有限公司);聚肌胞 (polyriboinosinic polyribocytidylic acid，poly I:C，美国Sigma公司)主要仪器:酶标仪 (美国Thermo Electron公司);小鼠跳台仪 (STT－2，医科院研制所);

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药

小鼠随机分成5组，分别为蛹虫草复方低、中、高剂量组0.6、1.1、3.4g生药/kg体重，空白对照组和模型组。模型组和给药组小鼠腹腔注射poly I:C(5mg/kg)造成慢性疲劳综合征模型，正常组每天给予生理盐水，共16天。复方蛹虫草制剂由蛹虫草、熟地黄、枸杞子、党参、大枣组成，均购自亳州市联华医药有限公司。将处方量药材投料，水煎煮2次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，浓缩得浸膏，加水混匀后灌胃给药。

1.2.2 力竭游泳实验

采用Thomas［4］等建立的方法并改进。末次给予受试物30 min后，置小鼠于游泳箱中，水深30 cm，水温 (23±1)℃，小鼠尾根部负荷5%体重的铅皮，记录小鼠游泳开始至死亡的时间作为小鼠游泳时间。实验共进行6次，分别为造模后6 h，以及造模后第4、7、10、13、16天。

1.2.3 开野实验

正方形开野实验箱为80 cm×80 cm×75 cm，底板为10 cm×10 cm的方格，其正上方距离底板90 cm高处放一60 W白炽灯泡。测试时将小鼠放于开野箱中央，观察10 min内小鼠的自主活动情况行走路线与格子交叉点数［5］。

1.2.4 跳台实验

末次给药30 min后，将小鼠置于跳台仪中，适应环境3 min，然后底部铜栅通以36 V交流电，小鼠学习跳上跳台躲避电击。24 h后检测小鼠的记忆情况，记录其5 min内跳下平台的次数 (错误次数)，以此作为学习成绩。

1.2.5 血清皮质酮含量测定

小鼠于造模后第16天摘眼球取血，每只小鼠取外周血0.2 mL，3000 r/min 4°C离心10 min。按照放免试剂盒说明书操作方法测定血清皮质酮含量。

1.2.6 脏器指数的测定

造模后第16天，小鼠处死后取出胸腺、脾脏，用电子天平称取其湿重，然后根据体重计算胸腺、脾脏指数。

1.2.7 Con A诱导小鼠脾淋巴细胞增殖

将小鼠断颈处死后，取脾脏并制成细胞悬液。以RPMI－1640培养基调整细胞浓度至5×106个/mL。在Con A(5μg/mL) 作用下置37°C、5%CO2条件下培养72h。培养结束后，离心，弃上清，每孔加入二甲基亚砜200μL，室温震荡，在酶标仪上570 nm处检测OD值。

1.2.8 CD4+和CD8+T淋巴细胞的表达小鼠于造模后第16天摘眼球取血，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，加入荧光标记抗CD4和CD8抗体，4℃避光反应30 min，30 min后用PBS洗涤2次，用400 μL 1%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞数。

1.2.9 统计学处理

所有数据均用统计软件SPSS13.0进行方差分析。

2 实验结果

2.1 蛹虫草复方对慢性疲劳小鼠力竭游泳时间，自发活动，学习能力和血清皮质酮水平的影响力竭游泳实验反映小鼠疲劳情况。由表1可见，和模型组相比，高剂量组能够显著延长疲劳小鼠的游泳时间 (P＜0.05)。开野实验是测定小鼠在一定区域一定时间内的活动数，反映了其自发活动，其活动数目增多或减少能够表示中枢神经系统的“兴奋”或“抑制”。实验结果表明，中剂量组和高剂量组均能够显著提高小鼠自发活动 (P＜0.05)。跳台实验能够反映小鼠的学习能力，模型组错误次数显著高于正常组，高剂量可以改善小鼠的学习能力，但没有统计学意义 (P＞0.05)。血清皮质酮含量反应内分泌系统功能，模型组小鼠血清皮质酮水平显著低于正常组，CCM能够剂量依赖性地提高皮质酮含量，高剂量组具有显著地改善作用 (P＜0.05)。

表1 复方蛹虫草制剂对慢性疲劳综合症小鼠力竭游泳时间、自发活动、学习能力、血清皮质酮的影响

2.2 蛹虫草复方对慢性疲劳小鼠脏器指数和淋巴细胞增殖的影响

胸腺和脾脏指数能够反映免疫情况。如表2所示，蛹虫草复方对模型组造成的胸腺增大没有拮抗作用，而对脾脏增大有抑制作用，和模型组相比，高剂量组抑制率可达59.23%(P＜0.05)。末次给药后取小鼠脾脏，体外用Con A刺激，模型组小鼠T淋巴细胞的增值能力显著下降，CCM能够剂量依赖性地提高其增殖能力，高剂量组几乎恢复到正常水平 (P＜0.05)。

表2 复方蛹虫草制剂对慢性疲劳综合症小鼠脏器指数、淋转刺激指数的影响

2.3 蛹虫草复方对外周血中CD4+T和CD8+T细胞的影响

造模后第16天，用流式细胞仪测定小鼠外周血中CD4+T和CD8+T细胞的表达情况。poly I:C能够通过增加CD4+T细胞数目以及减少CD8+T细胞数目从而提高CD4+T/CD8+T比值，蛹虫草复方能够改善两种细胞数目的异常，使其接近于正常水平。

表3 复方蛹虫草制剂对慢性疲劳综合症小鼠T细胞亚群的影响

3 讨论

慢性疲劳综合症的一个主要症状就是神经内分泌免疫系统紊乱，临床上也用免疫增强剂治疗该病［6］。CFS病人常伴随与病毒感染相同的症状并且在有些病人体内能够检测到一些病毒的存在，而这种潜在的病毒引起的感染可能通过调节神经－内分泌－免疫系统之间的相互作用导致CFS的发生。

CFS病人细胞免疫功能的改变表现为T效应细胞功能、淋巴细胞增殖功能、单核细胞吞噬抗原能力下降及T细胞亚群数目与比值的改变。上述细胞免疫功能的下降，可导致机体的清除能力和应答外来抗原的能力下降，从而使病毒可长期潜伏体内或外来抗原不能被清除。本实验采用腹腔注射poly I:C复制一种小鼠慢性疲劳模型，从整体上评价神经、内分泌、免疫和行为的异常症状，CCM具有明显的改善作用，可能对防治人类的慢性疲劳综合症具有潜在的价值。药物对poly I:C激活的胸腺功能没有作用，而是通过抑制脾的激活发挥作用，其具体作用机理有待于进一步研究。

［1］Komaroff A L.The biology of chronic fatigue syndrome［J］.Am J Med，2000，108(2):169－171.

［2］陈顺志.冬虫夏草和北虫草研究进展［J］.中国生化药物，1995，16(5):242－245.

［3］Katafuchi T，Kondo T，Take S，et al.Brain cytokines and the 5－HT system during poly I:C－induced fatigue［J］.Ann N Y Acad Sci.2006，1088:230－237.

［4］Dietert R R，Dietert J M.Possible role for early－life immune insult including developmental immunotoxicity in chronic fatigue syndrome(CFS)or myalgicencephalomyelitis(ME) ［J］.Toxicology，2008，247(1):61－72.

［5］Barker E，Fujimura S F，Fadem M B，et al.Immunologic abnormalities associated with chronic fatigue syndrome［J］.Clin Infect Dis，1994，18:S136－141.［6］Cleare A J.The HPA axis and the genesis of chronic fatigue syndrome［J］.Trends Endocrinol Metab，2004，15(2):55－59.