CREB特异性siRNA对人卵巢癌CAOV3细胞增殖的影响

叶丽平，马静方，杨春雨

(辽宁医学院基础学院，辽宁锦州121001)

卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，cAMP反应元件结合蛋白(CREB)在卵巢上皮细胞及颗粒细胞的生存中具有重要的作用［1］，与卵巢癌的发生、发展密切相关［2］。2010年4～7月，我们观察了CREB特异性siRNA对人卵巢癌CAOV3细胞增殖的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1．1 材料 人卵巢癌CAOV3细胞系(武汉大学保藏中心);脂质体 2000、Trizol、MTT(Invitrogen)，CREB特异性siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，兔抗人CREB、cyclin D1及β-actin(北京博奥森生物技术有限公司)，ECL试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)，RT-PCR试剂盒及引物(大连宝生物工程有限公司)。

1．2 实验方法

1．2．1 细胞干预及增殖抑制率检测 细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2常规培养传代。取对数生长期细胞接种于96孔板(1×104/孔)，每组设6个复孔随机分成实验组、阴性对照组和空白对照组。待细胞融合至40%～50%进行转染。实验组按照转染试剂说明书分别转染终浓度50、100、150 nM 的 CREB特异性 siRNA，阴性对照组转染等体积的脂质体，空白对照组不予干预，终体积均为100 μl。4 h后常规换液培养至48 h，加入5 g/L灭菌的MTT溶液，DMSO呈色，570 nm处测量样品的OD值。细胞增殖抑制率=1－(实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。

1．2．2 细胞干预及CREB、cyclin D1表达检测 将细胞接种于6孔培养板(1×104/孔)，分组及转染同前(终体积均为1 000 μl)，培养至48 h。Trizol法提取总RNA。cDNA合成条件:42℃反应30 min，99℃反应5 min，5℃反应5 min。PCR反应条件:94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环，循环结束后72℃延伸10 min。1．5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。Western blot法检测CREB、cyclin D1蛋白表达。Image J图像分析软件分析琼脂糖凝胶及蛋白条带的灰度值。以各组与β-actin灰度值的比值表示该组mRNA或蛋白的相对表达量。

1．3 统计学方法 采用SPSS16．0统计软件，计量数据以±s表示，组间比较用t检验，多样本比较用方差分析。检验水准α=0．05。

2 结果

细胞增殖抑制率及CREB、cyclin D1表达比较见表1。

3 讨论

CREB是真核生物细胞的核内蛋白质，是调节转录的核因子。细胞胞外信号可与细胞膜上的受体相互作用，经过PKA、PKC、PKB、ERK等信号通路使CREB磷酸化并激活，在CREB结合蛋白及其他特异性转录因子的调控下，结合相关基因启动区的CRE序列，提高CRE转录的活性，促进下游基因(如 c-fos、c-jun、BDNF、cyclin A、cyclin D)的转录及表达，进而调节细胞周期，促进细胞增殖、抑制凋亡等。多项研究表明，由CREB参与调控的靶基因在细胞增殖、分化、存活和细胞周期的调控中起重要作用。其过表达能促使细胞存活和增殖，在多种肿瘤的发生中具有重要作用［3～6］。

表1 各组增殖抑制率及CREB、cyclin D1表达比较(±s)

表1 各组增殖抑制率及CREB、cyclin D1表达比较(±s)

注:与阴性对照组比较，*P ＜0．05;与50 nM 比较，△P ＜0．05

组别 增殖抑制率(%) CREB mRNA CREB蛋白 cyclin D1 mRNA cyclin D1蛋白实验组50 nM 18．9* 0．26 ±0．01* 0．35 ±0．02* 0．38 ±0．02* 0．49 ±0．02*100 nM 35．5＊△ 0．20 ±0．02＊△ 0．26 ±0．01＊△ 0．30 ±0．01＊△ 0．39 ±0．04＊△150 nM 34．4＊△ 0．21 ±0．03＊△ 0．25 ±0．03＊△ 0．30 ±0．03＊△ 0．40 ±0．03＊△空白对照组 0 0．33 ±0．03 0．42 ±0．03 0．46 ±0．04 0．57 ±0．07阴性对照组1．1 0．33 ±0．04 0．43 ±0．03 0．45 ±0．05 0．56 ±0．05

研究证实，CREB表达水平及磷酸化程度在卵巢上皮细胞及颗粒细胞的生存中具有重要作用，卵泡刺激素和黄体生成素至少部分是通过cAMP细胞内信号通路调节卵巢的功能。Somers等［7］发现，CREB的ser133突变成Ala133，将不能被磷酸化激活，可明显抑制鼠卵巢颗粒细胞生存。说明CREB是促进卵巢生存的重要蛋白，在卵巢癌的发生发展过程中起重要作用［8］。肿瘤的发生发展不仅仅是癌基因的活化与抑癌基因的失活，还与凋亡相关基因的异常表达及生长因子过量表达、细胞周期失控有关。多数组织细胞发生恶性转化后，细胞周期缩短，增殖加快。目前，通过调节肿瘤细胞的周期变化，诱导其分化为正常或接近正常的细胞，从而抑制其无限制的增殖，已成为临床肿瘤疗和研究的全方向［9］。本研究发现，CREB特异性siRNA转染48 h后，可明显抑制细胞增殖，说明CREB参与调控肿瘤细胞的生长与增殖;CREB、cyclin D1的mRNA及蛋白表达显著降低，提示CREB可能参与调控cyclin D1的表达，与卵巢癌的发生发展密切相关，可能成为肿瘤治疗的新靶点。

总之，CREB特异性siRNA可有效抑制人卵巢癌CAOV3细胞增殖，其机制可能与CREB和cyclin D1的表达降低有关。

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