不同剂量辛伐他汀对多柔比星导致的乳鼠心肌细胞损伤的保护作用

潘建业，陈 星，顾 琳，王 好，张国辉

(镇江市第一人民医院，江苏镇江212002)

多柔比星(DOX)属蒽环类抗生素，在临床上广泛用于治疗多种恶性肿瘤，但该药存在心脏毒性，长期应用可导致心肌功能障碍，甚至心力衰竭［1］。近年来，多项研究发现他汀类药物除具降脂作用外，还可明显改善心衰患者及动物的心功能［2］。2010年10月～2011年9月，我们观察了辛伐他汀(SIM)对DOX损伤乳鼠心肌细胞的保护作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1．1 材料 新生SD大鼠，1～3 d，雌雄不拘，由江苏大学动物实验中心提供。DOX(美国 Enzo公司)，SIM标准品、胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)，DMEM-F12培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(美国Hyclone公司)，Annexin V/PI双染凋亡试剂盒(南京凯基生物有限公司)，一抗RyR2(美国Abcam公司)。其他试剂均为分析纯。

1．2 实验方法

1．2．1 细胞培养及干预 参照参考文献［3］的方法稍加改进，获取大鼠心肌细胞，按5×105的密度接种于6孔板(凋亡率观察时)、24孔板(RyR2蛋白检测时)中，37℃、5%CO2培养箱中静置培养。72 h的心肌细胞随机分为五组，对照组不予任何药物;DOX组予浓度为1 μmol/L 的 DOX 2 ～3 ml，SIM 低、中、高剂量组应用DOX 基础上分别予浓度为1、10、20 μmol/L的SIM 2～3 ml。继续培养24 h。

1．2．2 观察项目 ①搏动频率:倒置相差显微镜下观察。②凋亡率:干预后各组细胞均接种于6孔板中，0．25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 离心5 min，加入Binding Buffer混匀悬浮细胞;避光条件下先后加入Annexin V-FITC和PI，用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。③RyR2蛋白表达:用Western blot法检测。提取各组心肌细胞总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将凝胶上的蛋白转入PVDF膜，将PVDF膜室温封闭2 h后加入一抗，4℃冰箱过夜，第2天加入二抗孵育1 h，洗膜后暗室曝光、显影。

1．3 统计学方法 采用SPSS16．0统计软件。计量结果以±s表示，组间显著性检验采用单因素方差分析。检验水准α=0．05。

2 结果

各组心肌细胞搏动频率、凋亡率及RyR2蛋白表达见表1。

表1 各组心肌细胞搏动频率、凋亡率及RyR2蛋白表达比较(¯x ±s)

3 讨论

慢性心力衰竭是绝大多数心血管疾病发展的最后阶段，也是心血管疾病最常见的死亡原因。DOX是一种广谱抗肿瘤药，目前在临床上广泛用于治疗白血病等各种恶性肿瘤，但其存在心肌毒性且有剂量依赖性，长期应用可致心肌功能障碍甚至心力衰竭［1］。心肌功能障碍的一个主要标志就是心肌收缩功能下降，而Ca2+循环可以看作是心肌收缩和舒张的调节器［4］。当心肌细胞除极时，少量Ca2+经L型通道进入细胞，触发肌浆网通过RyR2将Ca2+释放到胞质引起心肌细胞收缩。肌浆网钙转运异常引起心肌细胞内钙超载及心肌损伤，导致心肌舒缩功能障碍，在心衰的病程中起重要作用。当心肌细胞中RyR2表达降低时，影响心肌的兴奋—收缩耦联，导致心肌收缩功能下降。研究发现，在心衰患者和动物中，RyR2的表达是下降的。因此钙调控蛋白的表达在心功能改善中起着重要作用［5，6］。

大量临床及实验表明，他汀类药物除具有降脂作用外，还有对心血管的多效性如抗氧化、抑制炎性反应、改善钙调控蛋白的表达等［2］。研究表明，心衰大鼠中RyR2表达明显下降，而给予SIM治疗后，心衰大鼠心功能改善，RyR2表达显著上升。Zheng等［7］发现，用SIM培养大鼠原代心肌细胞24 h后，RyR2蛋白表达水平明显升高。但SIM是否通过改善钙调控蛋白的表达，提高心肌的舒缩功能，以此来减轻DOX所致的心肌毒性尚未见文献报道。本研究发现，DOX组及SIM低、中、高剂量组的心肌细胞搏动频率、RyR2表达均明显低于对照组，凋亡率均明显高于对照组;SIM低、中、高剂量组的心肌细胞搏动频率、RyR2表达均明显高于DOX组，凋亡率均明显低于DOX组，且呈剂量依赖性。提示SIM对DOX损伤乳鼠心肌细胞有保护作用，且呈剂量依赖性，其机制可能与提高RyR2表达有关。

［1］Outomuro D，Grana DR，Azzato F，et al．Adriamycin-induced myocardial toxicity:New solutions for an old problem［J］．Int J Cardiol，2007，11(7):6-15．

［2］Tousoulis D，Chacrakida M，Stefanadi E，et al．Statins in heart failure．Beyond the lipid lowering effect［J］．Intl J Cardio，2007，11(5):144-150．

［3］郭俊芳，张赢予，陈蓉，等．骨髓间充质干细胞旁分泌途径与阿霉素损伤心肌细胞凋亡:怎样证明其抑制效应［J］．中国组织工程研究与临床康复，2010，10(14):1755-1759．

［4］Gerd H，Burkert P．Calcium cycling in congestive heart failure［J］．Mol Cell Cardiol，2002，3(4):951-969．

［5］Shao QM，Ren B，Harjot K，et al．Sarcoplasmic reticulum Ca2+transport and gene expression in congestive heart failure are modified by imidapril treatment［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，28(8):1674-1682．

［6］Xu YJ，Chapman D，Dixon IM，et al．Differential gene expression in infarct scar and viable myocardium from rat heart following coronary ligation［J］．Cell Mol Med，2004，8(1):85-92．

［7］Zheng X，Hu SJ．Effects of simvastatin on cardiac performance and expression of sarcoplasmic reticular calcium regulatory proteins in rat heart［J］．Acta Pharmacologica Sinica，2005，26(6):696-704．