hTERT siRNA对宫颈癌Hela细胞增殖及化疗敏感性的影响

牛高丽，温玉库

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，全世界每年有250 000例妇女死于宫颈癌［1］。2010年12月～2011年6月，我们观察了靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)siRNA对宫颈癌Hela细胞增殖及化疗敏感性的影响，旨在为宫颈癌的基因治疗提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料 Hela细胞，RPMI1640培养基，胎牛血清，EntransterTM-R转染试剂盒，Trizol Reagent，cDNA合成及RT-PCR试剂盒，兔抗人hTERT单克隆抗体，兔抗人 β-actin单克隆抗体，HRP标记羊抗兔IgG 抗体，3-(4，5-二甲基-2 噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)，胰蛋白酶，青/链霉素，顺铂，博来霉素，DMSO;hTERT化学合成siRNA序列参照文献设计，经广州锐博生物技术公司合成。正义链:5'-GGCACTGTTCAGCGTGCTCTT-3';反义链:3'-GAGCACGCTGAACAGTGCC-5';Control siRNA序列:正义链:5'-CCGTCGACGCGTACTTGGTTT-3';反义链:3'-CGGTCCAGAGCATCAACGG-5'［2］。

1．2 实验方法

1．2．1 细胞培养及转染 Hela细胞贴壁生长于含10%胎牛血清，1%青/链霉素的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞按1×106/孔接种于6孔培养板，待贴壁率达60%左右时将细胞分为 hTERT siRNA组、Control siRNA组、空载体组及空白细胞组，以新型纳米载体EntransterTM-R作为转染试剂，按试剂说明将hTERT siRNA、Control siRNA及空载体分别转染Hela细胞，转染siRNA终浓度为50 nmol/L。培养4～6 h后更换RPMI1640完全培养基，分别于24、48 h后收集细胞，每组设3个复孔。

1．2．2 hTERT mRNA表达检测 采用 real time-PCR法。于转染24 h后收集各组细胞提取总RNA，反转录合成cDNA，设计hTERT引物:5'-CATCGCCAGCATCATCAAACCC-3'，5'-AGGTCTGTCAAGGTAGAGACGTG-3'。内参照基因 3磷酸甘油醛(GAPDH)引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。由上海生工生物技术服务公司合成。使用SYBRGreen作为荧光染料，FITC2000实时荧光定量基因扩增仪进行检测，扩增条件:94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72℃30 s，30个循环。参照文献报道取 Ct(cycle thresh-old)值［3］。计算△Ct=Ct(目的基因)－ Ct(GAPDH)，再将各实验组样本的△Ct减去正常对照的△Ct，即得△△Ct。结果以 2-△△Ct表示。

1．2．3 hTERT蛋白表达检测 采用 Western blot法。稳定转染48 h后收集各组细胞消化离心，以蛋白裂解液提取细胞总蛋白，冰上裂解3 h，取变性蛋白样品20 μg进行SDS-PAGE蛋白电泳，通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜。用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h。按1∶2 000比例加入兔抗hTERT单克隆抗体(一抗)置于脱色摇床上孵育2 h，TBST液洗3次，各10 min。HRP标记羊抗兔IgG抗体(二抗)1∶5 000置于脱色摇床上孵育1 h，TBST液洗3次，各10 min，加显色剂，入暗室曝光、显影，图像扫描并以Image J软件进行灰度分析得出灰度值。以β-actin蛋白作为内参照。

1．2．4 细胞增殖活性测定 采用MTT法。取各组细胞以1×104个/孔接种于96孔板，每组设4个复孔，培养24、48、72 和96 h 时孔内各加入 10 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0．5%MTT)，培养4 h 后去除培养液，加入 DMSO 150 μl/孔，振荡 10 min，充分溶解结晶。于酶联免疫检测仪490 nm波长下测定各孔光吸收(A)值，以此表示细胞增殖活性。

1．2．5 化疗敏感性试验 各组稳定转染的细胞培养24 h后，分别用不同质量浓度顺铂、博来霉素处理，顺铂(1 mg/ml)至终质量浓度为 0．02、0．1、0．5、2．5、12．5 μg/ml，博来霉素(1 mg/ml)至终质量浓度为 0．01、0．1、1、10、100 μg/ml，以空白细胞作为对照，每组设4个复孔，继续培养48 h。每孔加入10 μl MTT溶液，37 ℃ 孵育 4 h，弃上清，加入 150 μl DMSO，振荡10 min，充分溶解结晶，选择490 nm波长，测定光吸收值(A490)，以此计算细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。用IC50计算软件得出细胞的半数生长抑制浓度(IC50)。

1．3 统计学方法 采用SPSS16．0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，率的比较采用χ2检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 hTERT mRNA、hTERT蛋白表达 见表1。由表1可见，hTERT siRNA作用Hela细胞24、48 h后，hTERT mRNA及蛋白表达均明显降低，和空白细胞组相比差异有统计学意义(P＜0．05)。而Control siRNA组、空载体组与空白细胞组相比差异无统计学意义(P ＞0．05)。

表1 各组hTERT mRNA、hTERT蛋白表达(±s)

表1 各组hTERT mRNA、hTERT蛋白表达(±s)

注:与空白细胞组比较，*P＜0．05

组别 hTERT mRNA(2-△△Ct)hTERT 蛋白(灰度值)hTERT siRNA 组 0．47 ±0．02* 1．36 ±0．27*Control siRNA 组 0．98 ±0．09 2．86 ±0．09空载体组 0．94 ±0．11 2．61 ±0．18空白细胞组1．00 2．79 ±0．16

2．2 细胞增殖活性 Control siRNA组、空载体组及空白细胞组增殖速度相近，差异无统计学意义(P＞0．05)，而hTERT siRNA组细胞增殖速度明显减慢，随时间增加而增加，表明靶向hTERT的siRNA使细胞生长受到抑制，见表2。

表2 各组细胞增殖活性(±s)

表2 各组细胞增殖活性(±s)

注:与空白细胞组比较，*P＜0．05

组别24 h 48 h 72 h 96 h hTERT siRNA 组0．419 ±0．021*0．645 ±0．013*0．772 ±0．019*0．869 ±0．007*Control siRNA 组0．578 ±0．018 0．941 ±0．005 1．118 ±0．012 1．159 ±0．009空载体组 0．607 ±0．023 0．901 ±0．014 1．149 ±0．026 1．153 ±0．033空白细胞组 0．597 ±0．011 0．906 ±0．022 1．239 ±0．034 1．183 ±0．016

2．3 抑制hTERT基因对Hela细胞化疗敏感性的影响 顺铂及博来霉素作用后的细胞存活率分别见图1、图2。由图可见，与其他各组比较，同一药物浓度时hTERT siRNA组细胞存活率最低(P＜0．05)。hTERT siRNA 组顺铂的 IC50为(2．19 ±0．02)μg/ml(P＜0．05)，Control siRNA 组、空载体组及空白细胞组IC50均无显著差异(P ＞0．05)，分别为(8．11 ±0．03)、(7．47 ± 0．28)、(7．94 ± 0．12)μg/ml。hTERT siRNA 组博来霉素的 IC50为(7．39 ±0．45)μg/ml，Control siRNA组、空载体组及空白细胞组分别为(99．08 ± 0．56)、(94．27 ± 0．35)、(98．17 ±1．05)μg/ml，hTERT siRNA 组两药的 IC50值均明显低于其他各组，P＜0．05;另三组间两药的IC50值比较均无统计学差异。

图1 Hela细胞对顺铂的敏感性试验

图2 Hela细胞对博来霉素的敏感性试验

3 讨论

端粒是位于真核生物染色体3'末端的一段富含G的DNA重复序列，对于维持基因的稳定性起重要作用，端粒酶可使端粒保持稳定的长度，而hTERT是端粒酶活性的主要限速因子［4］。以往研究证实，端粒酶的激活在宫颈癌的发生、发展中起重要作用，宫颈上皮内瘤变(CIN)时即可检测到端粒酶的表达，宫颈癌时其表达程度更高;端粒酶激活可能是宫颈癌变中的早期事件［5］。因此，hTERT是一个理想的治疗癌症的靶向目标，抑制hTERT的表达能明显抑制细胞增殖。抑制端粒酶活性的方法较多，包括反义核苷酸技术，核酶及一些小的合成分子［6］。RNA干扰是存在于植物和哺乳动物细胞中一种天然的基因沉默保护机制，siRNA可以特异性靶向mRNA使其降解从而阻止目的蛋白的表达，具有高效、特异、无毒等特点，因此设计靶向hTERT的siRNA能成为治疗肿瘤的一种方法。本研究发现，hTERT siRNA可抑制宫颈癌 Hela细胞中hTERT mRNA及蛋白水平的表达，细胞增殖受到抑制并随时间增加而增加，提示靶向hTERT的siRNA能抑制目的基因表达并抑制细胞生长。

顺铂是宫颈癌最基本的化疗药物之一，其可与DNA形成链内交联，抑制DNA合成，并通过caspases途径促进细胞凋亡［7］。而博来霉素可致DNA链的断裂，属于G2期特异性药物，是新辅助化疗中主要联合用药之一。据报道，化疗治疗宫颈癌的有效率大约为50%，且存在耐药及副作用，对于体积较大、复发的肿瘤总体治疗效率低。本研究发现，各组细胞存活率均随顺铂、博来霉素浓度的增加而降低，hTERT siRNA组细胞增殖活性明显低于其他各组，IC50浓度显著降低，提示hTERT siRNA可增强宫颈癌Hela细胞对化疗药物的敏感性。目前研究显示，细胞中hTERT与DNA修复过程有直接的关联，hTERT的异常表达促进了DNA的修复，可能与增强了与DNA修复相关的几个基因的表达有关，包括Rad51、hMLH1、hMSH6 等［8］，抑制 hTERT 表达可能增强了顺铂及博来霉素导致的DNA断裂作用。因此，我们认为将hTERT抑制与化疗药物联合使用可能有更好的效果。

总之，靶向hTERT设计的siRNA可明显抑制宫颈癌Hela细胞中hTERT表达，抑制细胞生长，并增强化疗药物的敏感性，可能为宫颈癌的治疗提供新的方向。

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