丙酮酸乙酯对癫痫持续状态大鼠神经元凋亡及XIAP、Caspase-3表达的影响

齐登斌,郑辑英,李光来,薛国芳

癫痫持续状态(status epilepticus,SE)是临床医学急症之一,可导致急性或持续性的认知及行为改变,尤其易致海马、大脑皮质等边缘神经元的损伤。细胞凋亡是一种受基因调控的自主性、程序性死亡过程,是SE后神经元死亡的重要形式。大量研究表明,X-染色体连锁凋亡蛋白抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)参与了多种脑损伤的凋亡调控机制,使Caspase-3活性下降,神经元凋亡减少,脑损伤减轻[1]。然而对于作用于Caspase-3发挥抗凋亡效应的XIAP在SE中的病理生理机制研究甚少。丙酮酸乙酯是近年来研究较多的新型脑保护剂[2],但丙酮酸乙酯对SE后的神经元损伤是否也具有保护作用尚未见报道。本实验旨在观察SE后大鼠神经元凋亡相关基因XIAP、Caspase-3的表达情况,并探讨丙酮酸乙酯对SE导致的大脑神经元损伤的影响及其可能机制,为丙酮酸乙酯应用于临床防治SE提供动物实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年雄性Wistar大鼠54只(山西医科大学实验动物中心提供),体重190 g～230 g;氯化锂、匹鲁卡品、丙酮酸乙酯均购自美国Sigma公司;XIAP兔抗鼠多克隆抗体购自北京博奥森生物科技有限公司;Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、T UNEL试剂盒、即用型SABC试剂盒、DAB试剂均购自武汉博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 雄性Wistar大鼠54只,随机分为对照组(N组)6只、模型组(M 组)和丙酮酸乙酯组(EP组)各24只,后两组按时间点分为4个亚组(6 h,12 h,24 h,48 h)。

1.2.2 动物模型建立 各组均采用灌胃法处理,EP组造模前15 min腹腔注射丙酮酸乙酯50 mg/kg,N组和M组给予等容积生理盐水。15 min后M组、EP组腹腔注射氯化锂按体重127 mg/kg,20 h后经腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30 mg/kg。N组腹腔注射等量生理盐水。观察大鼠出现癫痫发作的时间,SE达1 h时,给予地西泮10 mg/kg腹腔注射终止癫痫发作。参照 Racine评价标准。0级:无任何发作迹象;Ⅰ级:凝视,头面部轻微颤动;Ⅱ级:点头或湿狗样抖动;Ⅲ级:前肢局限性惊厥;Ⅳ级:具有后肢站立的全身强直性惊厥;Ⅴ级:具有站立伴摔倒的全身强直-阵挛性发作。

1.2.3 标本处理 M组和EP组大鼠分别于SE后相应时间点处死,N组同SE后6 h组处死。用25%乌拉坦4 ml/kg深麻醉后,立即断头取脑,置入4%的多聚甲醛中固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋后,在视交叉海马区连续切片,片厚5 μ m。

1.2.4 TUNEL染色 按试剂盒(POD)提供的方法进行严格操作,细胞核染成棕黄色颗粒者即为阳性细胞,即凋亡细胞。

1.2.5 XIAP、Caspase-3蛋白免疫组化检测 常规SABC法行免疫组化检测,DAB显色。每张切片取 5个(×400倍)视野,测定每个视野的阳性细胞数,取其平均值。胞浆或核膜染色呈棕黄色为蛋白阳性表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计分析软件,两组间的比较采用t检验,多组间的比较采用方差分析,检测结果以均数±标准差(±s)表示。

2 结 果

2.1 行为学观察 N组无癫痫发作。M组大鼠注射匹鲁卡品15 min～30 min后均出现节律性点头、咀嚼、流涎等动作,随后出现单侧或双侧前肢阵挛,此后出现前肢阵挛伴站立,进一步发展到全身强直阵挛发作伴站立、摔倒,反复发作,均达到Ⅳ级～Ⅴ级发作,呈癫痫持续状态。EP组大鼠也均达到SE,但痫性发作程度较M组轻,多在Ⅲ级～Ⅳ级,且潜伏期较长。

2.2 HE染色结果 N组神经元整齐排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,胞浆透明,染色质均匀分布,核仁清晰。M组出现嗜酸性神经元,细胞排列紊乱,胞体收缩,胞浆红染、胞核固缩胞。EP组也出现嗜酸性神经元,但排列尚可整齐,形态尚属正常。

2.3 细胞凋亡检测 N组仅见少量TUNEL阳性细胞表达。M组SE后6 h可见TUNEL阳性细胞表达,且随时间点延长而增加,24 h时达高峰,48 h时减少。EP组与M组凋亡阳性细胞数的变化相似,但相应时间点TUNEL阳性细胞数均显著少于M 组(除6 h外,P＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠海马 TUNEL阳性细胞数比较(±s)

表1 各组大鼠海马 TUNEL阳性细胞数比较(±s)

组别 6 h 12 h 24 h 48 h N 组 3.36±0.75 M 组 15.57±1.411) 30.50±2.121) 42.46±1.351)28.44±2.241)EP组 14.45±1.692) 19.62±1.302) 31.50±1.412)20.50±1.412)与N组相比,1)P＜0.05;与M组相比,2)P＜0.05

2.4 XIAP及Caspase-3免疫组化结果 XIAP、Caspase-3在 N组有微量基础表达。SE后6 h时M 组XIAP、Caspase-3开始增强,12 h时XIAP达高峰,Caspase-3显著增强;24 h时XIAP开始减弱,Caspase-3达高峰;48 h时两者均减弱。EP组与M组比较,各个时间点XIAP和Caspase-3表达差异均有统计学意义(除6 h外,P＜0.05)。详见表2、表3。

表2 各组大鼠海马XIAP阳性细胞数比较(±s)

表2 各组大鼠海马XIAP阳性细胞数比较(±s)

组别 6 h 12 h 24 h 48 h N 组 13.63±1.87 M 组 27.16±2.021) 41.44±2.641)35.54±2.911) 24.59±1.401)EP组 30.47±1.292) 53.09±2.372)42.52±1.322) 35.56±2.222)与N组相比,1)P＜0.05;与M组相比,2)P＜0.05

表3 各组大鼠海马Caspase-3阳性细胞数比较(±s)

表3 各组大鼠海马Caspase-3阳性细胞数比较(±s)

组别 6 h 12 h 24 h 48 h N 组 2.50±1.26 M 组 12.14±1.941) 20.63±1.441)34.57±1.511) 25.57±1.251)EP组 11.43±2.332) 14.55±1.462)23.63±2.772) 17.57±2.292)与N组相比,1)P＜0.05;与M组相比,2)P＜0.05

3 讨 论

在大脑癫痫持续状态损伤过程中伴有大量神经元凋亡,从而加重了神经元的损伤,这主要与细胞内钙超载及氧自由基产生有关。Caspase蛋白酶家族是执行中枢神经系统神经元凋亡过程的主要酶类,在神经元凋亡中发挥关键作用。Caspase-3是Caspase家族最重要的蛋白酶,也是凋亡发生的标志性酶。在正常细胞内Caspase以无活性的蛋白酶原形式存在,凋亡信号刺激靶细胞时通过Fas/FasL系统和粒酶B/穿孔素系统等途径以级联反应的形式被激活,活化的效应性Caspase-3是各种凋亡通路的共同中介,能直接或间接酶解一系列细胞存活所必需的蛋白,促进细胞凋亡的发生。因此,一旦Caspase-3启动便宣告细胞必定死亡。

凋亡抑制蛋白(IAPs)是迄今作用最强的内源性Caspase的抑制剂,IAP家族中XIAP是结构最典型、功能最全面、作用最强的,也是近年来与凋亡相关的研究热点[3]。XIAP具有特征性结构即杆状病毒重复序列结构(Baculoviral IAP repeat,BIR)及羧基端具有泛素连接酶E3活性的环指结构域(Ring finger domain,RING)。XIAP可通过其 BIR2抑制有活性的Caspase-3和Caspase-7,通过BIR3抑制有活性的Caspase-9,同时其具有的RING锌指结构可介导具有E3活性的XIAP本身和其靶分子的泛素化降解等多种途径来发挥抗凋亡作用[4]。研究证实,氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠 SE后观察到XIAPmRNA、Smac等表达现象,表明XIAP确实参与了SE后神经元损伤的调控过程[5]。本实验研究结果显示,N组仅有XIAP、Caspase-3基础量的表达;M组XIAP于SE后6h升高,12h达高峰,48 h减少,而Caspase-3于SE后6 h升高,24 h达高峰,与TUNEL阳性细胞的表达基本一致,进一步证实了XIAP可抑制神经元凋亡;EP组各个时间点Caspase-3、TUNEL阳性细胞数较M组减少(除6 h,P＜0.05),而 XIAP阳性细胞数增加(除6 h外均P＜0.05),表明丙酮酸乙酯能够通过上调XIAP、下调Caspase-3,从而发挥抗凋亡作用。

EP作为一种新型的脑保护剂越来越受到人们的关注。EP能抑制大鼠体内的氧自由基的氧化作用,是一种过氧化氢清除剂,具有防止自由基损伤的作用;EP可调节多种炎症介质的释放如 HMGBl、TNF-α及 IL-6等发挥抗炎症介质作用[6];对心脏、肝脏、小肠等多种器官缺血再灌注损伤(I/R)、内毒素损伤、休克等病理状况下EP均具有保护作用[7,8]。本研究显示在大鼠癫痫持续状态模型中,采用丙酮酸乙酯预处理可减轻癫痫发作的级别和减少神经元的凋亡,其可能机制是通过上调SE时大鼠脑组织内的XIAP的表达及抑制Caspase-3的生成,阻断凋亡信号传导通路及凋亡执行途径发挥抗凋亡作用。丙酮酸乙酯对SE后大脑的保护机制是多途径、多位点。

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