复方银思维对散发性老年痴呆模型鼠学习记忆能力及其海马神经元超微结构的影响

第五永长,田金洲,时 晶

阿尔茨海默病(AD)可分为家族性和散发性两大类,约占全部痴呆病例的65%,目前已成为老年人群中继心血管病、恶性肿瘤、中风之后的第四大“杀手”。其中,散发性老年性痴呆(SAD)约占AD的95%。与家族性AD的基因突变病因不同,SAD主要由一些遗传性危险因素、老龄以及环境性的危险因素所导致,是老年性痴呆中最可望通过药物干预的类型。

复方银思维是在清代名医陈士铎治疗呆病经验方的基础上经组方及剂量优化形成的有效成分提取物。本课题较系统的研究了该方防治SAD认知损害的作用及其可能机制。本文是课题研究的一部分,重点观察和探讨了该方对于SAD模型大鼠学习记忆能力的影响及其超微形态学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级健康雄性SD大鼠84只,体重(270±20)g,由第四军医大学实验动物中心提供(实验动物合格证号:0034642)。将大鼠随机分为假手术组(Sham-operated,S)、模型组(Model,M)、多奈哌齐对照组(Donepezil,D)、银思维小剂量组(YSW Small Dose,YS)、银思维中剂量组(YSW Middle Dose,YM)、银思维大剂量组(YSW Large Dose,YL)。每组动物14只。

1.2 SAD模型制备 参考Sharma等方法[1-4],除假手术组外,其余动物注射链脲佐菌素(STZ)约 18 μ L。坐标参考George Paxinos Charles Waston《大鼠脑立体定向图谱》[5]。假手术组以等量人工脑脊液替代STZ。术后常规饲养21 d后予以药物治疗。造模及饲养过程中动物死亡率为19.2%。

1.3 干预药物及给药方法 银思维由人参、半夏、茯神、附子、菖蒲等组成。由999企业集团医药股份有限公司提供中药提取物颗粒(产品批号:0908032)。实验过程中以60℃双蒸水溶解稀释,配成大、中、小剂量浓度,按生药计算的大鼠给药剂量为:大剂量30.42 g/(kg◦d);中剂量 15.21 g/(kg◦d);小剂量7.61 g/(kg◦d),按0.75 mL/100(g◦d)灌胃。多奈哌齐(中美合资西安海欣制药有限公司生产,药物购自第四军医大学西京医院药房)以0.92 mg/kg剂量,按0.75 mL/100(g◦d)灌胃。模型组及假手术组给予等体积的双蒸水。各组均每日1次,共灌胃2个月。

1.4 行为学测试 采用Morris水迷宫试验法。定位航行实验,空间搜索实验。

1.5 电镜观察 电镜样品处理:取出新鲜大鼠海马切割成1 mm3的组织块,投入2.5%的戊二醛固定液,固定2 h,待组织块下沉,0.01 mol/L PBS液冲洗3次,常温保存在0.01 mol/L PBS中,送电镜室。

2 结 果

2.1 行为学测试结果

2.1.1 定位航行试验 在5 d的定位航行试验中,各组大鼠的平均逃避潜伏期及总游泳距离都呈逐渐下降趋势,表明动物在历次学习训练过程中,学习寻找平台的能力均得到提高。在第1天的训练中,模型组与假手术组平均逃避潜伏期及总游泳距离无统计学意义,在随后的4 d中两组平均逃避潜伏期及总游泳距离表现出统计学意义(P＜0.01)。从第3天开始,多奈哌齐组,银思维小、中、大剂量组与模型组相比,平均逃避潜伏期及总游泳距离有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),其中以银思维中剂量、大剂量差异最为显著(P＜0.01)。第5天各治疗组与模型组相比,平均逃避潜伏期及总游泳距离均呈有统计学意义(P＜0.01)。除第2天结果显示银思维大剂量组与多奈哌齐组相比平均逃避潜伏期及总游泳距离有统计学意义(P＜0.05)外,其余时间多奈哌齐组与银思维小、中、大剂量组组间比较均无统计学意义。详见表 1、表2。

表1 大鼠在定位航行试验中的平均逃避潜伏期比较(±s)s

表1 大鼠在定位航行试验中的平均逃避潜伏期比较(±s)s

组别 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手术组 11 76.74±25.03 1.37±10.76 20.46±10.14 12.91±3.10 10.67±6.59模型组 11 294.69±7.01 88.98±26.022) 50.96±31.852) 47.43±30.502) 40.23±34.122)多奈哌齐对照组 12 78.92±24.19 66.95±26.47 27.99±17.48 28.26±25.97 15.62±13.583)银思维小剂量组 11 69.09±41.59 60.99±28.913) 25.89±20.463) 23.62±11.163) 16.75±13.304)银思维中剂量组 11 56.54±19.813) 40.69±19.144) 26.62±21.433) 30.68±27.753) 19.95±23.074)银思维大剂量组 11 66.29±20.853) 27.07±10.174)5) 19.84±11.894) 16.84±12.384) 11.19±7.984)与假手术组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较,3)P＜0.05,4)P＜0.01;与多奈哌齐对照组比较,5)P＜0.05

表2 大鼠在定位航行试验中的游泳距离比较(±s)cm

表2 大鼠在定位航行试验中的游泳距离比较(±s)cm

组别 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手术组 11 968.74±368.03 676.65±408.62 334.22±175.44 231.23±22.87 179.15±105.79模型组 12 1 210.51±303.78 1 093.50±498.431) 764.34±375.982) 748.82±376.272) 601.59±409.032)多奈哌齐对照组 12 1 063.38±407.53 755.59±348.043) 451.88±272.123) 408.39±244.893) 247.31±224.994)银思维小剂量组 11 822.28±544.56 665.53±493.533) 328.29±173.624) 316.62±146.444) 260.75±215.794)银思维中剂量组 11 742.90±313.50 529.96±329.794) 361.29±206.504) 461.85±387.993) 307.56±310.554)银思维大剂量组 11 968.91±400.43 422.41±204.954)5) 341.9136±171.924) 252.18±123.284) 157.18±105.474)与假手术组比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较,3)P＜0.05,4)P＜0.01;与多奈哌齐对照组比较,5)P＜0.05

2.1.2 空间探索试验 在第6天撤除平台后的试验中,与假手术组相比,模型组表现出在外环区域滞留较长,原平台附近活动很少,第1象限活动时间明显较短,两组第1象限活动时间比较有统计学意义(P＜0.01)。与模型组相比,各治疗组第1象限活动时间明显延长,其中银思维中、大剂量组在第1象限活动时间较之差异性最为显著(P＜0.01)。多奈哌齐组与银思维小、中、大剂量组组间比较均无统计学意义。详见表3。

表3 大鼠空间探索试验第1象限活动时间(±s)s

表3 大鼠空间探索试验第1象限活动时间(±s)s

组别 n 第1象限活动时间假手术组 11 59.49±8.56模型组 12 15.92±6.151)多奈哌齐对照组 12 41.01±10.762)银思维小剂量组 11 39.91±13.962)银思维中剂量组 11 52.81±4.293)银思维大剂量组 11 56.45±5.313)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 大鼠海马神经元超微结构改变 假手术组大鼠海马神经元细胞形态规则,核膜光滑,核仁清楚,染色质均匀分布,以常染色质为主。其中细胞器丰富,粗面内质网分布规则,线粒体发达,排列密集,未见肿胀,高尔基体极性明显。神经元轴突内微管排列整齐成束状,未见微管断裂、溶解等现象。组织间毛细血管结构完整,毛细血管内皮细胞间连接紧密,血管与脑组织间无间隙。

模型组大鼠海马神经元呈缺血样改变,核膜、核仁尚清晰。染色质浓缩,异染色质增多,靠近核膜边缘排列。细胞器结构有不同程度损坏,线粒体肿胀并有空泡变性,可见线粒体嵴泡状扩张。核糖体部分解聚,部分脱颗粒,高尔基体结构紊乱,呈部分扩张,粗面内质网扩张,有肿胀。神经元胞质偶见脂褐素颗粒、溶酶体增多。神经元轴突内微管结构有明显的断裂或溶解现象,多数区域微管消失,排列紊乱。毛细血管周围有水肿,组织间隙增大,水分增多,血管通透性增大。可见星型胶质细胞明显水肿。

中药各治疗组大鼠海马神经元微管无明显断裂和溶解,排列较整齐,轴突结构清楚,与假手术组接近。与模型组相比,各治疗组细胞病理程度均有很大改善,其中以中药大、中剂量组效果最为显著。电镜下可见神经元胞体形态规则,无固缩,神经元核膜、核仁清楚,核染色质分布均匀,以常染色质为主,毛细血管周围无水肿现象,组织间隙无增大。轴突轴浆丰富,线粒体结构正常,无肿胀。胞质细胞内器较正常,未见水肿。中药小剂量组微管排列尚可,部分结构不甚清楚。

3 讨 论

AD的病理特征主要为大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变,细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和细胞外老年斑(senile plaque,SP)沉积。其中NFT的数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关,被认为是AD患者神经原退化的病理基础[6]。NFT的主要成分是由异常过度磷酸化tau蛋白聚集而形成的双螺旋丝(paired helical filaments,PHFs)。近年研究显示,微管相关蛋白 tau的异常过度磷酸化不仅使其丧失催化微管装配和稳定微管结构的正常生物活性,还使其变成具有细胞毒性的分子,并促使其自身沉积为NFT[7],还可猎获正常的微管相关蛋白,使得微管崩解,轴突变性,细胞退化及丢失,最终导致AD患者的认知功能受到严重的损害。因此,从保护微管结构,防止轴突变性损伤着眼,抑制tau蛋白异常过度磷酸化及NFT形成,是防治SAD的重要策略。

AD属于祖国医学呆病、文痴、善忘、郁证等范畴。随着人口老龄化加剧以及中医药对复杂性疾病研究的不断深入,SAD已成为中医药防治老年性痴呆最有希望突破的疾病类型。中医学在本病的防治方面积累了较为丰富的临床经验,该领域的古籍文献得到越来越多的挖掘。部分名方的疗效已得到长期临床实践的检验,极有必要对其进行深入细致的实验研究,揭示其疗效机制,为中医药防治复杂性疾病提供范例。

本实验所用中药复方源自清代名医陈士铎治疗呆病之名方,原方由人参、半夏、茯神、枣仁、附子、菖蒲等中药组成。复方银思维是原方精炼优化后的有效组分提取物。全方依据中医益气温阳、开郁化痰治则拟定而成,寓消于补,标本兼治,具有升发阳气,祛逐阴邪,开郁化痰、平衡阴阳之功效。

实验采用国际认可的侧脑室注射STZ拟SAD模型。自从Blokland等[8]发现脑室注射STZ可通过降低海马神经元ChAt活性而引起大鼠的空间学习记忆能力下降之后,侧脑室注射STZ制备SAD模型方面的基础研究引起了许多学者的兴趣。美国de laMonte教授课题组[9]通过侧脑室注射STZ的方法阻断胰岛素受体自身磷酸化和内在的酪氨酸激酶活性,损伤胰岛素及胰岛素样生长因子(IGF)信号转导通路,结果发现,微量的STZ未引起外周血糖升高及胰腺结构和胰岛素的免疫活性改变,却导致脑体积缩小,细胞丢失、神经胶质增生、Aβ沉积增多、tau蛋白过度磷酸化、泛素化等惊人变化,学术界一致认为该模型成功地模拟了SAD的病理特征。STZ拟SAD模型动物在造模后21 d即可出现明显的学习记忆障碍[10]。近年来,这一模型被广泛采用作为SAD及“3型糖尿病”模型,用于AD的脑能量代谢及tau磷酸化等方面的研究。

实验采用的Morris水迷宫系统是由英国心理学家 Morris于20世纪80年代初设计并应用于与海马功能直接相关的学习记忆脑机制研究的空间学习记忆模型,它能够较准确地反映动物的空间学习和记忆能力,是目前进行动物行为学测试最为可靠的工具之一。

本实验结果表明,大鼠侧脑室注射链脲佐菌素可引起明显的AD样空间学习记忆障碍,模型组与假手术组相比有统计学意义;在学习能力测试的定位航行试验中,复方银思维提取物小、中、大剂量组均能显著缩短SAD模型大鼠在Morris水迷宫中找到平台的游泳时间及总游泳距离;在大鼠记忆保持能力测试的空间探索试验中,复方银思维提取物小、中、大剂量组均能显著延长大鼠在原平台所在象限的游泳时间,增加其在原平台附近的活动,提高大鼠搜索目标的策略。复方银思维提取物小、中、大剂量及西药多奈哌齐均可提高SAD模型大鼠的空间学习记忆能力,且银思维大剂量略优于西药多奈哌齐。从脑组织海马神经元超微结构来看,假手术组大鼠海马神经元轴突内微管结构完好,排列整齐成束状。模型组大鼠海马神经元轴突内微管结构有明显的断裂或溶解现象,多数区域微管消失,排列紊乱。银思维各治疗组大鼠海马神经元轴突内微管排列整齐,无明显断裂溶解,效果最好。侧脑室注射STZ很好地模拟了SAD空间学习记忆障碍,银思维提取物能显著改善SAD大鼠的学习记忆能力,其作用的超微形态学基础与保护微观结构,防止轴突损害有关。

复方银思维是中药有效成分提取物的组合物,其中含大量的人参皂苷。人参皂苷可以上调脑内乙酰胆碱水平和M-胆碱受体数量,提高突触效能和结构可塑性,抑制细胞的凋亡和坏死,促进海马的神经发生,具有良好的促智、抗衰老作用[11]。方中半夏、菖蒲、茯苓等辛开、甘缓类中药均是中医药治疗AD的高频药物。推测全方明显的改善学习记忆作用是上述药物及其有效成分的协同功效。对其改善SAD学习记忆障碍的深层机制与作用靶点值得进一步深入研究。

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