胺甲斑蝥素与氟桂利嗪抗惊厥作用的合理配伍方案1)

陈湘玲,张琴琴,王明正,肖 奕,廖玉芳,王新风

联合应用抗癫痫药物防治癫痫和难治性癫痫是充分利用相须、相使等协同增效作用以提高疗效,对有毒副反应的药物,则利用相制配伍,以抑制毒性,保证安全用药。氨甲斑蝥胺(4-A-mino-2-Methyl-Cantharidinimide,AMC)是近期合成的斑蝥胺衍生物。本课题组前期研究结果表明,AMC能够对抗最大电休克(MES)和(抗戊四唑M ET)发作,同时具有最小起效剂量低、达峰时间最快、半效期和作用持续时间长、消除较慢等特点。氟桂利嗪(FLU)作为添加剂治疗癫痫,特别是难治性癫痫,国外有多家基础和临床研究报道[1,2]。本课题采用等效线法对新化合物AMC和FLU进行配方,筛选药效协同、毒性拮抗的最佳配伍方案,为防治难治性癫痫提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康普通级昆明种小鼠,体质量18 g～22 g,雌雄皆用,由山西医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 药品 AMC分子量为272.30±36.5;由苏州大学医学部药学院药物化学教研室孙晓飞教授合成提供。FLU由西安杨森制药有限公司生产,批号070511025。

1.1.3 仪器 JY-Ⅰ型惊厥仪,山西医科大学研制;ZB-200疲劳转棒仪,成都泰盟科技有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 ED50测定 采用 Swingard法[3]稍加改良建立M ES模型。电刺激参数:频率8 Hz,刺激强度70 V,时间为0.4 s,后肢强直为MES指标。取小鼠700只,设生理盐水对照组、AMC组、FLU 组、AMC1∶FLU1组、AMC1∶FLU4组和 AMC4∶FLU1组,每组随机分为(6～8)个剂量组,每个剂量组 20只小鼠。给药剂量见表1。给药后60 min开始测定,记录惊厥数,计算抗惊率,做量效曲线比较各药的抗M ES作用,用Bliss法计算各药的 ED50。

表1 AMC和FL U及其3个配方在抗小鼠MES实验中的给药剂量 mg/kg

1.2.2 TD50测定 取健康昆明种小鼠432只,雌雄各半,实验前训练小鼠,10 min/d,共3 d,凡10 min内不落地者入选。小鼠分成生理盐水对照组、AMC组、FLU组、AMC1∶FLU1组、AMC1∶FLU4组和AMC4∶FLU1组,每组随机分为(6～7)个剂量组,每个剂量组12只小鼠,给药剂量见表2。各组小鼠灌胃给药后1 h,采用转轮法测定小鼠落地次数,超过3次者视为有中毒表现。所获数据作毒性量效分析,Bliss法计算各药的TD50,比较各组药对小鼠的中枢毒性。

表2 AMC和FLU及其三个配方在毒性实验中的给药剂量 mg/kg

1.2.3 等效线分析 药效等效线是由AMC和FLU两药的ED50在X、Y轴上两点连线形成,毒性等效线是由两药TD50在X、Y轴上两点连线而成[4]。若联合组的等效点及其95%的可信区间在等效线的下方,说明其药效或毒性为协同;如果联合组的等效点及其95%的可信区间在等效线上,说明其药效或毒性为相加;如果联合组的等效点及其95%的可信区间在等效线上方,说明其药效或毒性为拮抗。

1.2.4 统计学处理 组内比较使用两独立样本 t检验;抗MES作用的抗惊率的比较采用χ2检验;组间使用单因素方差分析中的L-S-D法进行两两比较;不同比例配伍的ED50、TD50两两比较用t检验。数据处理均在计算机上用SPSS13.0软件完成。

2 结 果

2.1 AMC、FLU单药和不同比例配伍的ED50测定 各组抗惊厥作用随着剂量增加而增加,即剂量与效应均呈正相关性,最大效能均可达100%。ED50从大到小依次为FLU(29 mg/kg)、AMC1∶FLU4(26 mg/kg)、AMC(25 mg/kg)、AMC4∶FLU1(25 mg/kg)、AMC1∶FLU1组(23 mg/mg)。详见表 3。

表3 AMC和FLU及其三个配方抗小鼠M ES的ED50测定结果

2.2 AMC和FLU不同比例配伍的TD50测定 各组毒性作用随着剂量增加而增加。TD50从大到小依次为 AMC4∶FLU1(779.0 mg/mg)、AMC(545.0 mg/mg)、FLU(479.0 mg/mg)、AMC 1∶FLU 1(470.0mg/mg)、AMC1∶FLU 4(452.0 mg/mg)。详见表4。

表4 AMC和FLU及其三个配方的TD50测定结果

2.3 AMC和FLU不同比例剂量配伍的等效线图分析

2.3.1 ED50等效线分析 不同剂量配伍后各组的ED50等效线分析结果见图1。图中由 AM C与FLU配伍比例 1∶0与 0∶1得出的ED50在X,Y轴上的连线,即药效等效线。AMC1∶FLU1和AMC1∶FLU4组的等效点及其95%的可信区间在等效线的下方,说明其抗惊厥作用为协同,AMC4∶FLU1组的等效点及其95%的可信区间在等效线上,说明其抗惊厥作用为相加作用。详见图1

图1 AMC和FLU及其三个配方ED50的等效线图

2.3.2 TD50等效线分析 不同剂量配伍后各组的TD50等效线分析结果见图2。图中由 AM C与FLU配伍比例 1∶0与 0∶1得出的TD50在 X,Y轴上的连线,即毒性等效线。AMC1∶FLU1和AMC1∶FLU4组的等效点及其95%的可信区间在等效线下方,说明其毒性作用协同,AMC4∶FLU1组的等效点及其95%的可信区间远离等效线而处于其上方,说明其毒性作用为明显的拮抗作用。详见图2。

图2 AMC和FLU及其三个配方TD50的等效线图

3 讨 论

大量文献报道,两药以不同剂量比例配伍,其效应和毒性会有所不同。Tallarida[5]提出,两药联合的效果与两药在联合中的剂量比例有关。因此,利用等效线法分析AMC和FLU及其1∶1,1∶4和4∶1三个不同比例配伍的抗惊厥效应和毒性的相互作用,采用等效线图选出最佳配伍方案。

本实验对胺甲斑蝥素与氟桂利嗪配伍的等效线图结果表明,AMC和FLU按4∶1比例配伍的抗惊厥作用相加,毒性拮抗,是两药联合应用时的最佳配伍方案。此外,在测定ED50和LTD50的实验中亦发现,尽管AMC和FLU及其三种不同剂量比例的配方均可发挥相似的抗惊厥效能(抗惊率均达100%),但4∶1比例配伍后达到相同抗惊厥效能时所用剂量小于单用AMC,而且对中枢神经系统的毒性作用最小。由此进一步证明AMC和FLU按4∶1配伍是两药联合应用时的最佳配伍比例。

[1]Pledger GW,Sackellares JC,Treiman DM,et al.Flunarizine treatment of partial seizures:Results of a concentration-controlled trial[J].Neurology,1994,44:1830-1836.

[2]Overwey J,Binmin CD,Meijer JW,et al.Double-blind placebo-controlled trial of Flunarizine as add-on therapy in epilepsy[J].Epilepsia,1984,25:217-222.

[3]Swinyard EA,Woodhead JH,White HS,et al.Experimental selection,quantification and evaluation of anticonvulsants[M].Antiepileptic Drugs,Raven Press,New Yo rk,1989:85-102.

[4]Jarogniew J,Luszcki.Interaction between oxcarbazepine and conventional antiepileptic drugs in the maximal electroshock test in mice:An isobolographic analy sis[J].Epiepsia,2003,44(4):489-499.

[5]Tallarida RJ.Statistical analysis of drug combinations for synergism[J].Pain,1992,51:381-382.