左乙拉西坦与拉莫三嗪对海马细胞保护的对比研究

雷 军,张占萍,钟雨秋,王为民

颞叶癫痫占所有癫痫类型的30%～35%,常为难治性癫痫,其结构特征为海马硬化[1],而细胞凋亡是颞叶癫痫海马神经元丢失导致海马硬化的重要途径[2]。本研究比较新型抗癫痫药物拉莫三嗪和左乙拉西坦对戊四氮致痫大鼠海马细胞凋亡的影响,对比两者对海马细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 普通级健康成年雄性Wistar大鼠,体重260 g～300 g,兰州大学实验动物中心提供。110只Wistar大鼠按体重随机分为正常组、模型组、阳性药物对照组(丙戊酸低、中、高剂量组)、治疗组 1(拉莫三嗪低、中、高剂量组),治疗组2(左乙拉西坦低、中、高剂量组)共 11组,每组 10只。

1.1.1 试剂及药物 戊四氮由美国Serva公司生产。免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产。丙戊酸钠由湖南湘中制药有限公司生产。拉莫三嗪由葛兰素史克公司生产。左乙拉西坦由比利时联合化工生产。

1.2 方法

1.2.1 癫痫模型制备 模型组、各阳性药物对照组和各治疗组大鼠每天腹腔注射戊四氮35 mg/kg,并观察其行为学变化30 min。行为学判断按 Racine分级法[3],Ⅰ级:湿狗样颤动,面肌抽动、咀嚼;Ⅱ级:节律性点头;Ⅲ级:前肢阵挛;Ⅳ级:站立伴前肢阵挛;Ⅴ级:失平衡、倾倒、四肢抽动、全身阵挛。以连续出现3次Ⅳ级以上发作作为点燃标准,正常组给予同体积生理盐水腹腔注射。全部点燃后,按丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦人的最大推荐剂量(丙戊酸钠3 000 mg/d,拉莫三嗪600 mg/d,左乙拉西坦4000 mg/d)的1/30,1/20,1/10分别为丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦低、中、高剂量组,即丙戊酸低剂量组[100 mg/(kg◦d)],中剂量组[150 mg/(kg◦ d)],高剂量组[300 mg/(kg◦ d)];拉莫三嗪低剂量组[20 mg/(kg◦ d)],中剂量组[30 mg/(kg◦ d)],高剂量组[60 mg/(kg◦ d)];左乙拉西坦低剂量组[130 mg/(kg◦d)]中剂量组[200 mg/(kg◦d)]高剂量组[400 mg/(kg◦d)]。模型组、正常对照组给予同体积生理盐水。丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦配制方法及动物给药:丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦用生理盐水配成所需浓度;大鼠给药容积1 ml/100 g,每天灌胃给药一次,共 3周。

1.2.2 取材和制片 药物治疗3周结束后各组大鼠进行心脏灌注固定,取海马组织。将组织块用4%中性甲醛固定4 h后,在20%的蔗糖中过夜,常规制作蜡块,切片。

1.2.3 免疫组化检测 每只大鼠取2张脑片,分别用于bax,bcl-2检测。免疫组化染色采用S-P法。Bax、Bcl-2阳性细胞为细胞浆内出现棕黄色颗粒,阴性对照细胞核染为蓝色且细胞核或胞浆内无棕黄色颗粒。

1.2.4 图像分析和数据处理 每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)计数Bax、Bcl-2阳性细胞数,然后求其平均值进行数据分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行处理,检测结果以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学观察 行为学按Racine法[3]分级判断:正常组无癫痫发作;模型组在注射戊四氮后3 min～6 min出现眨眼、动须、节律性点头、肢体抽搐及跌倒等。多为Ⅳ级～Ⅴ级,部分出现强直阵挛,甚至出现前、后肢伸肌强烈收缩,同时伴有喉鸣、口鼻流出血性泡沫、肢端青紫等。各阳性药物对照组、各治疗组在注射戊四氮后3 min～8 min出现眨眼、动须、节律性点头、肢体抽搐等,多数表现为Ⅲ级～Ⅳ级,少数为Ⅴ级而且仅表现跌倒,个别出现强直阵挛。行为学观察结果显示正常组没有癫痫发作,各阳性药物对照组与模型组比较发作开始时间延迟,发作级别下降;拉莫三嗪各组和左乙拉西坦各组与模型组比较发作开始时间未见延迟,发作级别未见下降。

2.2 免疫组化结果 在模型组中,Bcl-2和Bax表达都增加,阳性药物对照各组和治疗各组与模型组比较Bcl-2表达增加和Bax表达减少,说明左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸都具有通过Bcl-2表达增加和Bax表达下降来抑制凋亡的作用,其中左乙拉西坦和拉莫三嗪抑制凋亡的作用随剂量的增加作用增强,其中,低剂量组中,左乙拉西坦优于拉莫三嗪和丙戊酸,而后两者基本相同,中、高剂量组中,左乙拉西坦和拉莫三嗪均优于丙戊酸,而拉莫三嗪和左乙拉西坦基本相同。模型组与正常组比较Bax阳性细胞数增加,而Bcl-2阳性细胞数也增加(P＜0.01);各阳性药物对照组和各治疗组分别与模型组比较有统计学意义(P＜0.01)。详见表 1。

表1 拉莫三嗪对大鼠海马Bcl-2和Bax表达的影响(±s)

表1 拉莫三嗪对大鼠海马Bcl-2和Bax表达的影响(±s)

组别 Bax Bcl-2正常组 9.91±0.34 9.94±0.44模型组 19.96±0.291) 20.30±0.521)丙戊酸低剂量组 17.09±0.372) 22.53±0.542)丙戊酸中剂量组 13.90±0.292) 25.08±0.482)丙戊酸高剂量组 11.18±0.652) 30.15±0.512)拉莫三嗪低剂量组 16.90±0.682) 22.84±0.462)拉莫三嗪中剂量组 13.49±0.432) 25.56±0.402)拉莫三嗪高剂量组 10.45±0.422) 31.02±0.272)左乙拉西坦低剂量组 15.18±0.302)3) 24.21±0.472)3)左乙拉西坦中剂量组 13.50±0.382) 25.49±0.372)左乙拉西坦高剂量组 10.26±0.362) 31.14±0.332)与正常组相比,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.01;与 拉莫三嗪组比较,3)P＜0.05

3 讨 论

颞叶癫痫典型的病理改变包括神经细胞丢失,苔藓纤维芽生和胶质细胞增生,其中细胞凋亡是颞叶癫痫海马神经元丢失重要的途径[2]。

凋亡总体上有两种途径即内源性途径和外源性途径,内源性途径是通过调节线粒体释放细胞色素C来激活CASPASE9,外源性途径是通过激活细胞表面受体如FAS来激活CASPASE8或者CASPASE10[4],tBid(truncated Bid)提供内源性和外源性途径的连接[5]。决定是否处于凋亡状态的一个重要的因素是Bcl-2家族促凋亡成员如Bax,Bak等和抗凋亡成员如Bcl-2,Bcl-xl之间的平衡[2],同时Bcl-2家族也是癫痫发作引起的脑细胞凋亡的主要调节因素,通过下调抗凋亡成员Bcl-2和上调促凋亡成员 Bax来促凋亡[6]。本实验中,模型组中 Bcl-2和Bax表达都增加,说明机体处于凋亡状态时随着促凋亡成员Bax的表达增强,抗凋亡成员Bcl-2也表达增强,而各阳性药物组和各治疗组表现为Bcl-2表达增加Bax表达减少,说明左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸都可以通过增加抗凋亡成员Bcl-2的表达和减少促凋亡成员Bax表达来起到抑制凋亡,保护海马细胞的作用。

左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸目前已广泛应用于癫痫的治疗,其具有抗癫痫和神经保护双重作用[7]。本实验中,丙戊酸使戊四氮点燃的慢性癫痫大鼠发作起始时间延迟,发作级别有下降趋势,未出现强直阵挛;而左乙拉西坦和拉莫三嗪对戊四氮点燃的慢性癫痫模型无抗抽搐作用,但三者对大鼠海马区细胞Bcl-2表达增加和Bax表达减少与模型组比较有统计学意义,都有抑制凋亡的作用从而起到神经保护作用。其中,左乙拉西坦在各种剂量,拉莫三嗪在中高剂量时对大鼠海马区细胞Bcl-2表达增加和Bax表达减少与丙戊酸比较具有统计学意义。左乙拉西坦、拉莫三嗪在抑制细胞凋亡,神经保护方面优于丙戊酸,推测与左乙拉西坦和拉莫三嗪存在独立于抗癫痫作用的神经保护作用相关[8,9]。同时左乙拉西坦低剂量应用即显示出抗凋亡神经保护作用,而拉莫三嗪在中高剂量时与左乙拉西坦具有相似的神经保护作用,作为神经保护剂应用中注意剂量的选择。

本实验也证实两药具有确切的抗海马细胞凋亡,神经保护作用,相信左乙拉西坦及拉莫三嗪作为神经保护剂具有很好的发展前景。

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