人参三醇组皂甙对人视网膜色素上皮细胞增生和DNA合成的抑制作用

李晓华,王作书,王瑞卿,张 妍,明 月*

(1.吉林大学第二医院 眼科,吉林 长春130041;2.吉林省消防总队医院,吉林 长春130061)

人参三醇组皂甙(Panoxatriol saponins,PTS)是由西洋参根中提取,主要含有 Re、Rf、Rg1、Rg2和 Rh1,具有增强免疫功能、促进学习记忆、抗衰老、抗肿瘤、清除氧自由、改变碳水化合物和脂质代谢等多种生物学效应[1-3];本室以往研究已证实人参茎叶总皂甙(Ginsenoside of Stems and Leaves,GSL)(含 Rb2、Rc、Rd 、Re、Rf、Rg2)和西洋参根源人参二醇组皂甙(Rb1、Rb2、Rc、Rd)具有抑制 RPE 细胞增殖的作用,由于PTS与GSL的成分相近,我们进一步观察了PTS对培养的人RPE细胞增生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

培养的RPE细胞来源于孕32周流产胎儿人胚眼,主要试剂包括:改良的Eagle培养液(Delbecco,s modified Eagle,s medium DMEM 培养液)(GIBCO),胎牛血清(FCS,GIBCO),溴化二甲噻唑二苯四氮唑蓝(MTT,北京华美生物工程公司),二甲基亚砜(DMSO,国产分析纯),3H-TdR购自北京原子能研究所,放射强度为1 mCi。西洋参根源PTS由吉林大学基础医学院天然药物化学研究室惠赠,淡黄色粉末,实验前用DMEM溶解配成不同浓度。

1.2 方法

1.2.1RPE细胞的培养 人胚眼球在无菌条件下,沿扁平部剪开,剔除前部组织、玻璃体及视网膜感觉部,后节眼杯用PBS液漂洗后在解剖显微镜下分成4块展平后,放入DMEM培养液中,显微镜下剥离RPE层,将得到的 RPE置于0.25%胰蛋白酶(trypsin)中消化30 min,FCS终止消化,注吸法分离RPE,离心、清洗后接种于含20%FCS的DMEM 培养液,置于37℃,5%CO2的孵箱中培养。RPE细胞为贴附型细胞,取第5代用于实验。

1.2.2药物浓度与效应关系实验 RPE细胞经酶消化后制成细胞密度2×104/ml细胞悬液,每孔2 ml接种于24孔塑料培养板,孵育24 h后加入PTS,使其终浓度为 0 、5、10、50、100、150、200、300、40、500 μ g/ml,每种浓度3孔,培养12 h后,更换成不含药物的培养液继续培养24 h,Trypsin消化制成细胞悬液,给药组和对照组各取3孔台盼蓝染色计数,计算抑制率。细胞活力测定:取各样本细胞悬液0.9 ml加入1%台盼蓝0.1ml,混匀,血细胞计数板盲法计数,着色细胞为死细胞,以活细胞数占计数细胞的百分比反应细胞活力。

1.2.3时间与药物效应关系实验 同上接种细胞,孵育24 h后加PTS使其终浓度200 μ g/ml,对照组加入等量的DMEM培养液。分别于培养12、24、48、72、96和120 h经Trypsin消化后台盼蓝染色计数,计算增生抑制率。

1.2.4MTT比色法 取密度为4×104/mlRPE细胞悬液200ul接种于96孔板,孵育24 h后弃液,加入含PTS的培养液,PTS终浓度分别为50、100、200、300 、400 μ g/ml,对照 组加入等量 DMEM 培养 液,每组3复孔。培养12 h后用培养液漂洗细胞1次,加入 5 mg/mlMTT(Sigma)10 μ l和 190 μ lDMEM,继续培养 6 h,弃液 ,每孔加入 DMSO 100 μ l,振摇 10 min,用Bio-RAD550型酶联免疫检测仪在490 nm波长下读取吸光值(A值),进行t检验并计算生存率和EC50。

1.2.53H-TdR掺入法步骤同1.2.4,给药后培养24 h,每孔加入3H-TdR1 μ Ci,继续培养 12h,Trypsin 消化制成细胞悬液,收集细胞于纤维滤膜,洗涤,凉干后置入闪烁瓶中,加入二甲苯闪烁液,用液化闪烁计数仪测定每分钟计数值(counts per minute,CPM),进行t检验并计算掺入抑制率。

2 结果

2.1剂量-效应关系RPE细胞数随PTS浓度增加而减少,PTS 在5 、10、50 、100、200、300 、400 、500 μ g/ml对细胞增生的抑制率依次为22.02%、37.00%、48.62%、64.53%、74.92%、81.96%、83.18%和82.26%。

2.2时间-效应关系贴壁生长良好的RPE细胞在给药后12 h可见部分细胞脱落,在所观察的12、24、48、72、96、120 h 点,与对照组相比 PTS 组 RPE 细胞增生的抑制率分别为37.93%、59.53%、74.64%、79.11%、80.91%和80.53%;于给药后96 h内,其抑制效应随时间而明显增强,各组细胞活力均在90%以上。

2.3PTS对RPE细胞增殖的抑制作用PTS的A值明显低于对照组(见表 1),其中50 μ g/ml组 P＜0.05,其余 4 组(100、200、300、400 μ g/ml)P ＜0.01:PTS 对人胚RPE细胞的EC50为64.3 μ g/ml。

表1 不同浓度PTS作用下RPE的生存率

2.4PTS对RPE细胞DNA合成的抑制作用PTS组CPM值随药物浓度增加而降低(见表2)。

3 讨论

增殖性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)被认为是眼内炎症、孔源性视网膜脱离(Retinal Detachment,RD)、外伤、眼内手术后的损伤修复过程,是由多种细胞、生长因子、细胞因子、胶原和细胞外基质相互作用的病理过程。病理学研究表明视网膜色素上皮细胞(RPE)是发生PVR时最重要的细胞,RPE在病理情况下可移行至玻璃体内并在玻璃体内散布、增生、合成胶原及其它细胞基质,并具有成纤维细胞样作用[4]。PVR是引起视力障碍甚至失明的严重眼病之一,是导致RD手术失败的最常见原因。玻璃体手术虽可有效治疗PVR,但术后仍有一些病人复发,最终导致视力丧失,探讨PVR的药物治疗逐渐成为国内外眼科工作者的研究热点。本实验通过细胞计数法、MTT比色法和3HTdR掺入法探讨PTS对RPE细胞增生的影响,结果发现PTS对培养人胚RPE细胞增生具有抑制作用,在一定时间(96小时)和剂量范围内(50 μ g/ml至400 μ g/ml)存在时间依赖和剂量依赖关系。我们还发现贴壁生长良好的RPE细胞在给药后12小时即可见部分细胞脱落,贴附是贴附型细胞生长增殖的条件之一,通常细胞表面有由细胞分泌的糖蛋白膜,即细外衣,它对细胞运动尤其是贴附于支持物生长有重要作用[5]。细胞外衣的性质与细胞物质膜电位、酸碱失衡有关,改变细胞外衣的性质可使细胞由支持物上脱落下来。有研究表明RPE细胞中游离钙的浓度调节细胞吞噬功能状态、细胞增殖及细胞与基底膜的粘附力[6];同时钙离子还是细胞收缩、吞噬、物质转运与代谢及酶活性调节的基础调控者[7]。大量实验证实PTS和所含单体Rg1、Re具有抑制细胞外钙内流降低膜电位[8-10];此外,PTS中单体Rg2还具有抑制钠内流的作用[11]。由此推测PTS可能可能通过阻滞钙通道改变细胞内钙浓度引起细胞粘附力、增殖力下降,同时干扰细胞内酶活性和物质代谢;同时通过抑制钙和钠离子内流改变膜电位抑制RPE过度增增殖。由于正常活细胞线粒体内活性脱氢酶可将MTT还原为紫色的甲潜(formazan),且细胞的存活数与其产生的甲潜的A值之间存在线性关系。MTT比色法发现给药组细胞甲潜产生量少于对照组,A值明显低于对照组,细胞生存率随药物浓度增加而下降,进一步证实PTS可干扰细胞代谢。Popovich等证实PTS可导致人白血病细胞THP-1的DNA断裂[12],本实验通过3H-TRP掺入实验证实PTS可抑制RPE细胞DNA合成,其抑制作用在一定浓度范围内药物随浓度的增加而增强。

表2 人胚RPE细胞在PTS作用下DNA合成抑制率

PTS可通过抑制DNA合成,并可能通过抑制钙和钠的内流、改变膜电位、干扰细胞代谢、改变细胞外衣的性质而抑制RPE细胞增殖。PTS作用与PDS相似,PTS能否抑制RNA、胶原合成及对PVR动物的治疗作用尚在研究中,PTS有望成为治疗PVR的有效药物。

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