灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

肖冬来, 邓慧颖, 谢荔岩, 吴祖建, 谢联辉

(福建农林大学植物病毒研究所,福建省植物病毒学重点实验室,福州 350002)

灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)不仅是禾本科作物的重要害虫,也是一些病毒病的传毒介体。目前已知灰飞虱可传播的病毒有水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice blackstreaked dwarf virus,RBSDV)。近年来,由于水稻种植品种、耕作制度、暖冬气候等原因造成了灰飞虱数量逐年增加[1]。2004-2005年,江苏省RSV每年发病面积达170万hm2[2],2008年江苏一些地区的黑条矮缩病平均发病率达到54.6%,发病植株几近绝收,并有逐步蔓延加重的趋势[3]。近年来,对这两种病毒的分子生物学研究取得了一些进展,病毒编码的一些基因功能得到了鉴定[4-6],但关于病毒与寄主互作方面的研究还比较少,尤其是病毒与介体昆虫之间的互作。

构建cDNA文库是研究功能基因组学的主要手段之一,通过构建酵母双杂交cDNA文库,以某个蛋白为诱饵筛选cDNA文库对大规模研究蛋白间的互作有着重要的意义。本研究以灰飞虱mRNA为模板,利用Gateway技术构建了初级灰飞虱cDNA文库,并将其转换到载体pDEST22中,构建了高质量的酵母双杂交cDNA文库,为下一步研究灰飞虱与其传播的病毒间的互作奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

灰飞虱采自江苏水稻田间,经斑点免疫杂交和PCR检测不携带水稻条纹病毒,其后代饲养于台中本地1号品种幼苗上,室温保持在25～28℃,每4 d更换1次水稻幼苗,适时浇水。

1.1.2 主要试剂

T rizol、FastTrack·2.0 Kit、CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit、ProQuestTMTwo-Hybrid System、PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Midi Purification Kits均购自Invitrogen公司,T4 DNA Ligase均购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取

称取灰飞虱1～2 g,在液氮中研磨后,用Trizol试剂提取组织总RNA(具体操作参考说明书),并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行检测和质量分析。

1.2.2 mRNA的分离纯化

利用FastT rack·2.0 Kit对提取的灰飞虱总RNA分离纯化mRNA(具体操作按参考说明书),利用紫外分光光度计检测mRNA的质量。

1.2.3 cDNA的合成

按照CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit的操作手册进行：取 2 μ g mRNA 为模板,加 DEPC-treated water 至 9 μ L,再 加 入 BiotinattB2-Oligo(dT)primer、10 mmol/L dNTPs 各1 μ L,混匀,于65 ℃孵育5 min后45 ℃冷却2 min,加入事先混合好的5×First Strand Buffer 4 mL,0.1 mol/L DTT 2 μ L,DEPC-treated water 1 μ L,45 ℃2 min;最后 加 入 2 μ L SuperScriptTMII RT 2 mL,混匀,45℃孵育60 min合成第1链cDNA;向合成好的第 1链中加入 92 μ L DDW,30 μ L 5×Second Strand Buffer,10 mmol/L dNTPs 3 μ L,E.coli DNA Ligase 1 μ L,E.coli DNA 聚合酶 I 4 μ L,E.coli RNaseH 1 μ L,16 ℃ 2 h 后加入 2 μ L T4 DNA聚合酶,混匀,16℃2 min后终止反应;酚氯仿抽提、乙醇沉淀后与attB1接头连接,在50 μ L连接体系中加入 18 μ L 新合成的双链 cDNA,10 μ L 5×Adapter buffer,10 μ L attB1(1 μ g/μ L),0.1 mol/L DDT 7 μ L,5U T4 DNA连接酶,16℃连接过夜。将带有attB接头的cDNA通过BP反应构建到pDONR222载体上。

1.2.4 初级cDNA文库总克隆数CFU的鉴定

将插入cDNA的pDONR222载体转化ElectroMAXTMDH10BTMT1 Phage Resistant感受态细胞,37℃250 r/min复苏1 h后保存于含40%甘油的SOC液体培养基中,-80℃保存。取转化后的细菌原液(2 mL)10 μ L稀释 1 000倍后,从中取出50 μ L 涂布 LB 平板(含 50 μ g/mL Kan),37 ℃倒置培养过夜,总克隆数按照CFU=平板上的平均克隆数×稀释倍数×103/涂布体积(μ L)×2计算。

1.2.5 初级文库平均插入片段及重组率鉴定

随机挑取在平板上生长的单克隆,以pDONR222载体上的通用引物M13F和M13R进行菌液PCR,检测插入片段的大小。

1.2.6 初级文库pDONR222质粒提取

取3×106个克隆,接种于50 mL肉汤培养基(牛肉膏0.3 g,蛋白胨1.0 g,NaCl 0.5 g,水 100 mL,pH 7.0～7.2)中,37℃,275 r/min振荡,当吸光度到达A600约0.6,细胞的浓度大约是 1.5×1010cells/mL(1 A600≈2.5×1010cells/mL)时,停止振荡培养。按照PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Midi Purification Kits的方法提取pDONR222文库质粒。

1.2.7 酵母双杂交文库构建及扩增

构建完成初级文库并对文库质量初步鉴定后,通过LR反应将文库cDNA从pDONR222载体转换到酵母表达载体pDEST22上,反应体系如下：pDONR222 文库 质粒 N μ L(300 ng)、pDEST22(150 ng/μ L)3 μ L 、5 ×LR Clonase Reaction Buffer 4 μ L 、LR Clonase 6 μ L,加 T E 至 总 体积 20 μ L,25℃反应20 h;乙醇沉淀 LR重组产物,重悬在9 μ L TE中,利用电转法转化大肠杆菌DH10B细胞,加入2 mL SOC液体培养基,37℃复苏1 h,转化液用SOC液体培养基稀释10倍后全部涂于100块15 cm 的LB平板(含100 μ g/mL Amp),37℃倒置培养过夜,无菌操作刮下菌苔,悬浮于20%甘油保存液中,分装后-80℃保存,此即为扩增文库。

1.2.8 扩增文库滴度的鉴定

取10 μ L扩增文库的原液,进行10倍连续梯度稀释,将每个稀释梯度取100 μ L涂布LB平板(含100 μ g/mL Amp),37 ℃倒置培养过夜,计算每个梯度平板上生长的平均菌落数量。按照公式：文库滴度=平板上的克隆数×稀释倍数×103/涂布体积(μ L)计算 。

1.2.9 扩增文库平均插入片段及重组率鉴定

方法同1.2.5,采用pDEST22上的通用引物进行扩增。

1.2.10 cDNA插入片段测序分析

随机挑取cDNA文库中10个克隆进行测序,测序结果通过GenBank中的Blast功能进行比对,寻找相似序列。

2 结果与分析

2.1 灰飞虱总RNA的提取及mRNA的分离

提取的灰飞虱总RNA经紫外分光光度计测定分析 ,A260/A280=1.983,浓度为 2.11 μ g/μ L 。 取少量RNA经琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示所提取的总 RNA 28S和18S清晰、完整(图 1),表示RNA未降解,质量高,纯化的mRNA较清晰,大小分布均匀,可用于下步文库的构建。

2.2 初级cDNA文库质量的检测

根据1.2.4中的总克隆数计算公式得出初级cDNA文库的库容量为1.85×107cfu。从平板上随机挑取32个转化子菌落,通过菌液PCR检测插入片段及重组率。从图2可以看出,灰飞虱初级文库cDNA插入片段主要分布在1 000～2 000 bp之间,平均插入片段大于 1 300 bp,具有良好的多态性。在所检测的32个转化子中有1个为空载体,根据公式：文库重组率=(有插入片段的转化子/总转化子)×100%,计算出文库的重组率约为97%。

图1 总RNA和mRNA琼脂糖凝胶电泳图

图2 灰飞虱初级cDNA文库插入片段的PCR检测

2.3 扩增文库质量的检测

根据1.2.8中的文库滴度计算公式,计算得出扩增文库的滴度为7.7×108cfu/mL,总库容量为1.5×109cfu。从平板上随机挑取 34个克隆进行菌液PCR鉴定,从图3中可以看出扩增文库的插入片段主要集中在1 000～1 500 bp之间,具有较好的多态性。34个克隆中有1个为空载体,所以扩增文库的重组率约为97%。较高的文库滴度、库容量和重组率保证了文库的完整性和覆盖度。

图3 灰飞虱酵母双杂交cDNA文库插入片段的PCR检测

2.4 cDNA插入片段测序分析

通过对随机挑取的10个克隆进行测序,结果在GenBank数据库中进行Blast比对后分析得知,10个克隆中有7个可以在数据库中找到高度同源的序列,其中L2、L7在插入时所编码的蛋白与已知的蛋白读码一致,没有发生移码。

表1 文库质粒cDNA插入片段序列比对分析

3 讨论

一个高质量的cDNA文库不仅要有高的代表性,也要能保证所插入cDNA片段的完整性,所以从RNA的提取到mRNA的纯化过程都必须严格操作,避免RNA的降解,这是保证所构建文库具有高库容量的先决条件。试验中所提取的灰飞虱总RNA质量高,纯化的mRNA大都分布在1～12 kb之间,达到了文库构建的要求。一个真核生物细胞中约有5×105个mRNA拷贝,扣除操作误差和系统误差,所构建的cDNA文库至少应具有1×106cfu的库容量[7]。Invitrogen公司的酵母双杂交文库构建系统采用了Gateway技术,该技术位点特异性重组构建载体,且通过ccdB基因来筛选阳性克隆,这不仅提高了操作的便捷性、高效性,也提高了阳性克隆率。通过对构建的灰飞虱cDNA文库的分析表明,初始文库的库容量为1.85×107,从而保证了文库的覆盖度。由于采用的是在cDNA两端分别加上attB1和attB2接头进行位点特异性重组构建载体,保证了能够定向重组进载体,也避免了限制性酶切和连接的过程,从而保证了插入的cDNA片段的方向和序列完整性,同时也降低了嵌合克隆出现的几率[8],大大提高了文库构建的质量。有研究表明插入片段在mRNA中的位置是有一定倾向性的,其位于基因5′端和3′端的比例约为69%和29%[9],5′端的非编码区往往带有终止密码子,这就阻碍了插入片段在酵母中的正确表达,在对灰飞虱文库随机挑取的10个克隆进行测序分析中发现能够在酵母中正常表达蛋白没有很快提前终止的有3个,而表达的蛋白能够比对到具有较高同源性的只有2个(L2、L7)。为了克服由于插入片段中非编码区带有终止密码子造成的提前蛋白翻译终止,Invitrogen公司还提供了3阅读框构建文库的技术,其原理是通过引入3个不同接头,使得插入片段能够包含3种不同的读码方式,从而进一步保证了文库筛选的完整性。

目前只有少数几种昆虫已经完成了全基因组测序,且在GenBank数据库中已报道的灰飞虱基因也很少,随机挑取的10个克隆中有3个没有比对出具有较高同源性的序列,在其他8个克隆中,L2和L9与已经发布的两条灰飞虱序列具有较高同源性,分别为灰飞虱细胞色素氧化酶亚基II、灰飞虱alpha 1微管蛋白。利用该灰飞虱 cDNA文库,通过直接PCR,我们已经成功克隆了一些与昆虫核糖体蛋白L40同源的灰飞虱基因(未发表结果)。更多的灰飞虱基因的克隆乃至全基因组测序对利用酵母双杂交技术研究一些基因与灰飞虱的互作将起到重要的作用。

通过cDNA文库可筛选一些目的基因,对于非模式物种来说是一种具有重要意义的有效手段[10]。酵母双杂交系统具有快速、灵敏的特点,已被广泛用来研究蛋白间的互作。在植物病毒与昆虫介体的互作研究中也有报道[11-12]。本试验中构建的灰飞虱酵母双杂交文库具有较高的完整性和覆盖度,达到了酵母双杂交筛选的标准,可以用来研究RSV、RBSDV与介体灰飞虱间互作,以这两种病毒的功能蛋白为诱饵筛选与之互作的灰飞虱蛋白,以便更深入了解昆虫介体传毒机制。

[1]陈丹,杨国友.江苏省主要抗水稻条纹叶枯病品种的推广及其应用价值[J].上海农业科技,2006(3)：42-46.

[2]张恒木,孙焕然,王华弟,等.水稻条纹病毒分子生物学研究进展[J].植物保护学报,2007,34(4)：436-440.

[3]李彦红,许永久.水稻病毒病的防治[J].安徽农学通报,2009,15(12)：119.

[4]Xiong R Y,Wu J X,Zhou Y J,et al.Identification of a movement protein of Rice stripe tenuiv irus[J].Journal of Virology,2008,82：12304-12311.

[5]Xiong R Y,Wu J X,Zhou Y J,et al.Characterization and subcellular localization of an RNA silencing suppressor encoded by Rice stripe tenuivirus[J].Virology,2009,387：29-40.

[6]张凌娣,王朝辉,王献兵,等.两种植物病毒编码蛋白的基因沉默抑制子功能鉴定[J].科学通报,2005,50(3)：219-224.

[7]冯飞,梁佳勇,纪春艳,等.链格孢菌(Alternaria tenuissima)cDNA酵母表达文库的构建[J].中国农学通报,2009,25(12)：25-29.

[8]Ohara O,Temple G.Directional cDNA library construction assisted by the in vitro recombination reaction[J].Nucleic Acids Research,2001,29(4)：e22.

[9]武景阳,李朝翠,孔清华,等.利用修饰的随机引物构建非洲爪蟾酵母双杂交定向cDNA文库[J].动物学研究,2008,29(4)：368-372.

[10]张震,王教瑜,杜新法,等.稻曲病菌cDNA文库的构建[J].植物病理学报,2008,38(5)：462-467.

[11]M orin S,Ghanim M,Sobol I.The GroEL protein of the whitefly bemisia tabaci interacts with the coat protein of transmissible and nontransmissible begomoviruses in the yeast twohybrid system[J].Virology,2000,276(2)：404-416.

[12]Visser P B,Bol J F.Nonstructural proteins of Tobacco rattle virus which have a role in nematode-transmission：expression pattern and interaction with viral coat protein[J].Journal of General Virology,1999,80：3273-3280.