无机化合物对南方根结线虫作用方式的研究

白春明, 段玉玺*, 陈立杰, 刘轶飞, 于晓飞

(1.沈阳农业大学植物保护学院北方线虫研究所,沈阳 110866; 2.沈阳农业大学园艺学院,沈阳 110866)

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是一种典型的土传病害,也是当今防治困难的世界性难题。该病害已经蔓延至全球,每年仅对世界上重要的经济作物造成的损失就高达数百亿美元[1]。线虫长期存活在土壤中,土中的化学物质及多种植物所需的营养(无机化合物)对南方根结线虫2龄幼虫(J2)的作用尚不清楚。目前有关秀丽小杆线虫(Caenorhabditiselegans)环境胁迫尤其是重金属毒性作用的研究比较多[2-3],因为秀丽小杆线虫易于在实验室培养,繁殖速度快而可大量获得,从受精卵发育到成虫仅需不到4 d时间,试验周期短,已经成功应用于土壤与环境中毒物毒性评估与毒理学研究[4]。而南方根结线虫试验周期长,获得大量虫源比较困难,有关无机化合物对南方根结线虫的致死作用及作用机理的研究少之又少。我们在前期工作中筛选出南方根结线虫敏感的化合物 NH4HCO3、CuSO4◦5H2O和FeCl3◦6H2O,这些化合物在低浓度下就可使J2致死。其中硫酸铜是众所周知的杀菌剂,碳酸氢铵可作为基肥或追肥,且有报道称有望成为杀线剂[5]。因此,我们进一步研究了敏感化合物溶液在离体条件下对南方根结线虫J2的致死作用,对其运动行为、个体发育的影响及在胁迫处理下对J2呼吸作用和体液渗漏的影响,初步了解3种无机化合物对南方根结线虫J2的作用方式。

1 材料与方法

1.1 供试线虫

根结线虫采自辽宁省沈阳市东陵区浑河站乡前赛村日光温室内黄瓜上。单卵囊用0.4%NaClO消毒后接种番茄感病品种‘L402'(接种土经180℃干热灭菌,‘L402'由辽宁省农业科学院惠赠)上进行扩繁,培养温度为25～28℃,接种30～45 d后,番茄根系上有大量卵囊出现,取出根系,用水轻轻冲洗,获得雌虫和2龄幼虫(J2),经严格鉴定为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。待扩繁2代后,从感病番茄根系上挑取新鲜卵囊,用0.4%NaClO消毒3 min,再用无菌水冲洗3次,置于培养皿中,于25℃恒温箱中培养,每隔24 h换水1次,保证每次选用的J2新鲜、活力一致。

1.2 供试化合物

经前期试验确定南方根结线虫最为敏感的无机化合物为 NH4HCO3、CuSO4◦ 5H2O、FeCl3◦6H2O[6],试验均采用分析纯试剂。

1.3 无机化合物不同时间处理对南方根结线虫J2存活及致死时间的影响

在体式显微镜下挑取新鲜活跃的南方根结线虫J230条,放入1.5 mL离心管中,内有配制好的无机化合物 NH4HCO3、CuSO4◦5H2O、FeCl3◦6H2O LC50和LC90的溶液,分别为0.03 mol/L和0.04 mol/L、0.000 4 mol/L和0.000 5 mol/L、0.000 7 mol/L和0.001 1 mol/L,每管溶液体积为1 mL。分别处理0.5、1、3、6、12 h和 24 h 后在体式解剖镜下观察,记录存活数量。无菌水处理为对照,每处理重复3次。

线虫校正死亡率=[(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)]×100%。结果应用Excel 2003和SPSS 13.0软件进行分析,并计算各化合物 LC50和LC90浓度下J250%死亡时间和90%死亡时间。半数致死时间定义为死亡线虫数占测试线虫总数一半时的时间;90%死亡时间定义为死亡线虫数占测试线虫总数90%时的时间。

1.4 无机化合物对南方根结线虫J2运动行为的影响

运动行为的测定主要参照T salik和Hobert的方法[7]。

将新鲜活跃的南方根结线虫J2放入浓度分别为LC50和LC90的NH4HCO3、CuSO4◦5H2O和FeCl3◦6H2O溶液中,每1 mL药液放入30条J2,分别处理0.5、1、3、6、12 h 和 24 h,在体式解剖镜下观察并记录1 min内J2身体弯曲的次数。身体弯曲频率：1次弯曲定义为线虫相对于身体长轴方向上的1个波长的移动。同样方法记录1 min内头部摆动次数和J2运动的次数。头部摆动频率：J2头部从一侧摆向另一侧后,再摆动回来。基本运动能力：J2在1 min内向前、向后和向前运动时,方向上出现小于120°的转角运动的次数。无菌水处理为对照,每处理记录10条J2运动行为,试验重复3次。

1.5 无机化合物对南方根结线虫J2个体发育的影响

用无机化合物NH4HCO3、CuSO4◦5H2O和FeCl3◦6H2O处理J2后测量其体长、口针长度和透明尾长度的变化。体长指沿线虫体轴纵向的长度。将新鲜活跃的南方根结线虫J230条放入浓度分别为 LC50和 LC90的体积为 1 mL溶液中,分别处理3、6、12 h和24 h后,挑取J2放在载玻片上用Motic数码生物显微镜照相系统观察、摄像并保存图片,测量体长,无菌水处理为对照,每处理记录10条J2的数据,试验重复 3次。口针长度和透明尾长用NH4HCO3、CuSO4◦5H2O 处理 24 h后测量(活跃的J2不宜摄像且脂肪粒多看不清口针长度及透明尾长)。

1.6 无机化合物对南方根结线虫J2呼吸作用和体液渗漏的影响

无机化合物对南方根结线虫J2的呼吸作用采用溶氧仪测定法,对其体液渗漏的影响采用电导率测定法。配制线虫悬浮液,J2浓度为2×104条/mL,分别用 NH4HCO3、CuSO4◦5H2O 和 FeCl3◦6H2O 的 LC50浓度处理 J20.5、1、3、6、12 h 和 24 h,用溶解氧测定仪(JPSJ-605)测定各处理线虫的呼吸强度,计算药剂对J2呼吸的抑制作用。用电导率仪(DDSJ-308A)测定各处理J2悬浮液的电导率。以纯水及药剂原溶液为对照。每次处理重复3次。试验在25℃水浴中进行。

线虫实际吸氧量(mg/L)=相应对照原溶液溶解氧-线虫悬浮液溶解氧;

线虫悬浮液实际电导率(μ s/cm)=线虫悬浮液电导率-相应对照溶液电导率。

2 结果与分析

2.1 无机化合物不同时间处理对南方根结线虫J2存活及致死时间的影响

试验结果表明,南方根结线虫J2随着处理时间的增加和浓度的升高致死率上升(图1)。所有化合物处理6 h后J2死亡率急剧上升,其中CuSO4◦5H2O对J2的致死效果比其他化合物高。以CuSO4◦5H2O LC50浓度处理 24 h后致死率达 71.11%,LC90浓度处理24 h致死率高达96.67%。在LC90浓度下3种化合物50%致死时间不超过10.14 h、90%致死时间不超过22.66 h。南方根结线虫J2对3种化合物敏感性依次为：CuSO4◦5H2O＞NH4HCO3＞FeCl3◦6H2O(表1)。

图1 无机化合物胁迫对南方根结线虫J2存活的影响

表1 无机化合物对南方根结线虫J2致死时间的影响1)

2.2 无机化合物对南方根结线虫J2运动行为的影响

试验结果表明,3种无机化合物均随着时间加长显著减少了南方根结线虫J2的运动行为,表现为J2身体弯曲频率、头部摆动频率和运动频率降低。所有药剂处理均降低了J2身体弯曲频率。3种化合物不同浓度处理6 h前无明显规律,6 h后LC90浓度比LC50处理对J2身体弯曲频率的抑制作用强。当 NH4HCO3和 CuSO4◦5H2O分别以LC90浓度处理1 h时,J2身体弯曲频率比对照显著升高,之后开始迅速降低。除了FeCl3◦6H2O外,NH4HCO3和CuSO4◦5H2O在 LC90浓度下处理12 h以上时J2基本无身体弯曲的能力(图2上)。硫酸铜LC90处理1 h时J2突然加快了头部摆动频率,随后迅速降低。其他基本与身体弯曲频率结果相似(图2中)。对于运动能力的影响,NH4HCO3和CuSO4◦5H2O分别处理1 h时LC90比 LC50运动能力提高,但没有对照高。化合物胁迫后,J2运动能力比身体弯曲频率和头部摆动频率受到的影响程度高,尤其是CuSO4◦5H2O处理24 h时运动能力为零(图2下)。

2.3 无机化合物对南方根结线虫J2个体发育的影响

南方根结线虫J2的体长为346～ 463 μ m,口针长度 10～ 12 μ m,透明尾长度 6～ 13.5 μ m。本试验结果表明,所有处理无论时间长短还是浓度高低J2体长与对照相比显著(p＜0.05)缩短,同一种化合物高浓度比低浓度处理后体长短。CuSO4◦5H2O在LC90除了3 h处理外均比其他化合物处理J2体长短(图3)。化合物胁迫下口针长度与对照相比显著变长,并且超出了正常口针长度范围。NH4HCO3和CuSO4◦5H2O在2种浓度处理下J2口针长度变化不同。NH4HCO3高浓度处理比低浓度处理下J2口针长,而CuSO4◦5H2O高浓度下比低浓度短。同样,化合物胁迫下透明尾长度比对照显著变长,但仍在正常透明尾长度范围内,且同一种化合物高浓度处理比低浓度处理透明尾长度变长(表 2)。

表2 无机化合物处理南方根结线虫J2 24 h后口针和透明尾长度变化1)

2.4 无机化合物对南方根结线虫J2呼吸作用和体液渗漏的影响

无机化合物对南方根结线虫J2呼吸有强烈的抑制作用。从图4可以看出,3种无机化合物处理下线虫的吸氧量比对照溶液中低,说明胁迫下南方根结线虫J2吸氧率低,呼吸作用受到了抑制。当处理12 h以上呼吸作用停止。

图4 无机化合物对南方根结线虫J2呼吸作用的影响

无机化合物处理南方根结线虫J2后,线虫悬浮液的电导率均比对照增加。从图5可以看出3种化合物处理线虫液的电导率变化有所不同。

图5 无机化合物对南方根结线虫J2体液渗漏的影响

硫酸铜和氯化铁胁迫0.5～3 h后线虫悬浮液的电导率急剧上升,而后趋于平稳,电导率几乎不变。而碳酸氢铵胁迫3 h后线虫悬浮液电导率也处于上升趋势,直至处理24 h,但比前两个化合物胁迫下线虫的电导率低。其中硫酸铜处理12 h以上,悬浮液的电导率最高为45.80 μ s/cm,比对照线虫悬浮液的电导率增加了24.87%。

3 讨论

2龄幼虫是南方根结线虫侵染寄主根系的唯一虫态。因此,影响J2存活及活动能力的药剂都能抑制其对植物根部的侵染,减少南方根结线虫对植物根系的危害。本试验中3种供试化合物在LC90浓度下使J250%致死时间不超过10.14 h,90%致死时间不超过22.66 h,离体条件下均对南方根结线虫J2存活有强烈的抑制作用,并且可显著降低南方根结线虫J2的运动行为,导致J2身体弯曲频率、头部摆动频率和运动能力降低、体长缩短、透明尾变长。对毒性机理研究的模式线虫秀丽小杆线虫报道较多。郝伟等[8]研究表明,重金属铅、镉显著降低矮小拟丽突线虫(Acrobeloides nanus)平均体长,并抑制其生长发育及繁殖。王大勇等[2,9-11]研究表明,铜、钡、铝、铬暴露可使秀丽小杆线虫体长变短,运动行为发生严重缺陷,且这种表型与行为缺陷很大程度上可以从暴露当代传递到后代个体中。这些与作者的试验结果相似,本试验结果中透明尾变长可能是内含物的外渗透明区更加明显导致。这些变化能否传递到后代需进一步研究。

线虫是需氧生物,氧气的含量不仅影响线虫的存活,也影响线虫的孵化。缺氧可以降低土壤中线虫的数量,Stolzy等1960年研究表明,氧气分压为0时,南方根结线虫的种群数量显著减少[12]。大多数植物寄生线虫体重为1～2 μ g,单个虫体消耗氧气为10-3μ L/h,这一数值很小,因此对于线虫呼吸的研究比较困难,有关这方面的报道也非常少见。祁之秋等[13]研究表明二硫氰基甲烷对根结线虫呼吸有抑制作用,药剂处理的线虫悬浮液电导率明显高于对照,与本研究结果相似。线虫的呼吸受到抑制且处理12 h以上时呼吸率为0,这可能是随着线虫死亡率的升高线虫呼吸率极低,而溶解氧测定仪精确度不高,无法测出接近0的数据。线虫体壁由表皮层和下皮层组成,是线虫抵御外界不良环境条件和感受虫体内部微细化学变化的重要结构。药剂是作用于线虫体壁,使内容物外泄导致电导率升高致线虫死亡,还是通过口针或口腔进入肠道破坏了线虫肠道结构,引起体液外渗导致线虫死亡,有待进一步研究。

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