黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马的生物活性

张瑞明, 赵冬香, 万树青

(1.农药与化学生物学教育部重点实验室,华南农业大学昆虫毒理研究室,广州 510642;2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,儋州 571737)

茶黄蓟马(Scirtothrips dorsa lis Hood),又名茶黄硬蓟马、脊丝蓟马,属缨翅目,蓟马科,是芒果树和茶树的主要害虫,在我国海南、广东、广西、福建、云南等芒果种植区均有分布。常见为害对象还有香蕉、葡萄和花生等作物。在海南,芒果受茶黄蓟马的危害尤为严重[1]。该虫成、若虫为害芒果嫩叶、花穗及幼果,早期在叶背取食,随着虫口的增加,蓟马转移到叶表面取食。以成虫、若虫锉吸芒果树汁液,造成嫩叶、幼果表面组织锉伤呈木栓化,叶片变色,严重影响芒果嫩叶和幼果的生长发育[2]。近年来,随着海南省农业产业结构的改变,热带地区的海南芒果种植面积大幅度增加,茶黄蓟马的为害呈上升趋势,如不及时采取有效的防治措施,将导致芒果严重减产,甚至失收[1]。目前,对芒果上茶黄蓟马的防治主要依赖化学方法,但化学农药的过度频繁使用无疑会加剧蓟马抗药性产生,杀伤大量天敌,破坏生态平衡。因此,寻找高效、安全、易降解的新型杀蓟马药剂显得尤为紧迫。

黄皮[C lausena lansium(Lour.)Skeels]属芸香科黄皮属(Clausena)植物,别名黄批、黄弹、黄皮子、黄弹子、黄檀子、黄坛子等[3],为原产于我国热带以及亚热带地区的一种特产果树,在我国至少已有1 500年的栽培历史。黄皮具有很高的药用价值,其果、叶、根、种子均能入药,含有香豆素、生物碱等活性成分[4]。目前,有关黄皮在抑菌、除草和杀虫方面的报道很多。刘序铭等[5]报道,黄皮植株甲醇提取物对香蕉炭疽病菌和辣椒炭疽病菌等有一定的抑制活性。其中黄皮果核甲醇提取物对香蕉炭疽病菌菌丝生长的抑制率达到88.83%。卢海博等[6]报道,黄皮果核提取物在8mg/ML的处理浓度下,经紫外光(波长365 nm)照射2 h后,对稗草的根、茎、鲜重的抑制率分别为 87.84%、60.38%、18.40%,非光照处理为 77.99%、45.71%、14.44%;表现出了一定的光活化除草活性。万树青等[7]报道黄皮种子甲醇和石油醚提取物对萝卜蚜具有很高的杀虫活性。但对茶黄蓟马的活性研究还未见报道。本文以茶黄蓟马为研究对象,从触杀和驱避作用两方面研究黄皮种子提取物对茶黄蓟马的生物活性,并对杀蓟马的活性物质进行初步分离,为开发出经济、安全、有效的植物源杀蓟马剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试虫

黄皮种子,购于广州市清平中药材市场。

茶黄蓟马若虫,采自中国热带农业科学院环境与植物保护研究所温室大棚内芒果的嫩叶上。

对照药剂为70%吡虫啉水分散粒剂,由拜耳作物科学公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 黄皮种子粗提取方法

将购买的黄皮种子干品,置于电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘干,粉碎机粉碎,过60～80目筛。所得黄皮种子干粉用密封袋密封遮光处保存备用。

称取一定量的黄皮种子干粉,加入5倍体积的甲醇进行浸提,置于避光阴凉处,浸提每次持续72 h以上,期间数次摇动,浸提3次,将提取液合并,抽滤,经旋转蒸发仪减压浓缩至干,得黄皮种子甲醇粗提物,置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 活性成分的初步分离

采用液-液分配萃取法,称取10 g黄皮核粗提物,用少量的甲醇溶解后,加入400 ML蒸馏水,转入1 000 ML的分液漏斗中,用石油醚300 ML/次萃取3次。再用乙酸乙酯300 ML/次萃取3次,接着用正丁醇300ML/次萃取3次,最后得到的为水相萃取物,将各部分萃取液浓缩至干,4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 生物活性测定方法

1.2.3.1 驱避活性测定

将黄皮种子甲醇提取物样品用丙酮配制成2.5、5、10、20 g/L 4个浓度梯度的稀释液,备用。参考周琼[8]和张方平[9]的方法：将鲜嫩的芒果叶片带叶脉剪成直径为30mm的小圆碟,并保证叶脉两侧的叶面对称一致,然后以叶脉为界,用干净的毛笔在叶片一侧的正反两面用试液涂布均匀,另一侧用丙酮处理作为对照,待叶片晾干,将叶片叶面朝上置于垫有湿棉花的培养皿内,用大小均匀规则的湿棉条沿叶片边缘围住叶片防止蓟马逃逸。然后将大小一致、健康的蓟马用毛笔轻轻挑在叶片上,每侧15头,共30头。用保鲜膜封住培养皿,用昆虫针在保鲜膜上扎若干个通气孔。每个浓度梯度为一个处理,每个处理重复4次。将培养皿置于温度为(25±0.5)℃、相对湿度为75%±3%、光周期为L∥D=12 h∥12 h的人工气候箱中,于12 h和24 h检查处理和对照叶片两侧的蓟马数(叶脉上的蓟马不计算在内),并计算驱避率。计算公式如下：

1.2.3.2 触杀活性测定

采用浸叶法[10]：将黄皮种子甲醇提取物用少量的甲醇(低于1%)溶解,滴加少量的吐温-80乳化,加无离子水配制成5、10、20、40、60 g/L 共5个浓度梯度的药液,并将对照药剂吡虫啉配制成0.017 5、0.035 、0.07、0.14、0.28 g/L 5 个浓度梯度的药液。取新鲜完整大小一致的芒果小圆碟叶片(直径约为30mm)浸入药液中5 s,取出叶片用吸水纸吸去多余药液,放入洁净的培养皿中,培养皿内铺滤纸,滴清水保湿。每片叶用小毛笔轻轻移入试虫20头,每个处理3次重复,以含有少量吐温-80的蒸馏水作对照。最后用保鲜膜封好培养皿,并用针在保鲜膜上扎若干个通气孔。将培养皿置于温度为(25±0.5)℃、相对湿度为75%±3%、光周期为L ∥D=12 h∥12 h的人工气候箱中,于12 h和24 h检查试虫的死亡情况(死亡标准：以试虫不能正常活动或者轻轻触动虫体无任何反应视为死亡[11]),并计算死亡率与校正死亡率。计算公式如下：

1.2.4 数据处理方法

死亡率采用Duncan’s新复极差检验法(DMRT法)进行方差分析,用Finney几率分析法求出毒力回归式,并对其进行卡方适合性检验,求出LC50及其95%置信限。所有数据采用Microsoft Excel 2003与DPS v7.05软件处理。

2 结果与分析

2.1 黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马的驱避活性

黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马的驱避作用结果见图1。从图1可以看出,黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马具有很好的驱避活性,在2.5 g/L浓度时,对茶黄蓟马12 h和24 h的驱避率分别达到62.07%和63.64%;而在20 g/L浓度时,对茶黄蓟马12 h和24 h的驱避率分别高达92.86%和89.91%。同时,图1显示在试验阶梯浓度下黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马12 h和24 h的驱避率,随着浓度的增加而呈上升趋势。另外,在相同处理浓度下,不同处理时间的驱避效果有所不同,整体分析,12 h时的驱避效果要强于24 h时。

图1 黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马的驱避作用

2.2 黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马的触杀活性

黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马的触杀作用结果见表1。从表1可知,黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马具有一定的触杀活性,在处理后12 h和24 h对茶黄蓟马的致死中浓度(LC50)分别为16.60 g/L和12.85 g/L;而对照药剂吡虫啉则显示出其很好的毒杀效果,在处理后12 h和24 h对茶黄蓟马的致死中浓度(LC50)分别为0.045 g/L和0.027 g/L。

表1 黄皮种子甲醇提取物处理12 h与24 h后对茶黄蓟马的触杀效果

2.3 黄皮种子各萃取相对茶黄蓟马的触杀活性

将黄皮种子甲醇粗提物进行液-液萃取,分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相萃取物,并将其分别配制成5 g/L的浓度,采用浸叶法测定上述几种萃取物对茶黄蓟马的触杀活性,结果见表2。从表2可以看出,黄皮种子甲醇提取物不同溶剂萃取物对茶黄蓟马的触杀活性具有明显的差异。在相同处理浓度下,石油醚萃取物的触杀活性最强,对茶黄蓟马24 h的校正死亡率为49%。而其他三相萃取物对茶黄蓟马的触杀活性则很差。

表2 黄皮种子甲醇提取物的不同溶剂萃取物对茶黄蓟马24 h的杀虫活性1)

3 讨论

万树青等[7]在研究几种植物提取物对萝卜蚜的光活化杀虫活性时,发现黄皮种子甲醇提取物和石油醚提取物对萝卜蚜具有一定的杀灭作用。其中,当黄皮种子甲醇提取物浓度在1～5 mg/ML的范围内时,萝卜蚜的死亡率为60%～90%。马伏宁等[12]研究发现黄皮种子甲醇提取物对松材线虫(Bursaphelenchus xy lophilus)具有很高的毒杀活性,在1mg/ML浓度下处理72 h的校正死亡率为100%。这些研究表明,黄皮种子中可能含有对多种农业害虫有效的活性物质,具有很大的开发潜力。而且黄皮的整个果实(包括果皮、果肉和种子)长期被作为一种水果和中药材使用,从黄皮种子中提取的杀虫化合物对人类和环境相对安全。

本试验研究结果表明：黄皮种子甲醇提取物对茶黄蓟马具有很好的驱避作用和一定的触杀活性,且随着处理浓度的升高而增强。该结果再次显示了黄皮种子代谢产物的杀虫广谱性和多种杀虫作用方式。在不同溶剂的萃取物中,石油醚相萃取物对茶黄蓟马具有明显的触杀活性,而其他三相的触杀活性则很差,表明黄皮种子中的杀蓟马活性物质主要存在于石油醚相,这为进一步从黄皮种子中分离杀蓟马活性物质提供了科学依据。总之,要从黄皮种子中开发出杀蓟马剂,在活性成分的分离纯化和杀蓟马活性化合物鉴定以及作用机理、田间试验等方面还有待深入研究。

[1]陈泽坦.吡虫啉等几种杀虫剂防治芒果茶黄蓟马试验[J].农药,2003,42(1)：24-25.

[2]陈泽坦.我国芒果树蓟马种类记述[J].植物保护,2004,30(4)：88-89.

[3]黄雪松,罗丽君.黄皮果、黄皮核中黄皮酰胺的测定[J].食品工业科技,2006,27(6)：172-173.

[4]闫少羽,崔承彬,姚新生.黄皮属植物生物碱的研究进展[J].中国药物化学杂志,2002,12(3)：179-186.

[5]刘序铭,马伏宁,万树青.黄皮甲醇提取物的抑真菌作用[J].植物保护,2008,34(2)：64-66.

[6]卢海博,万树青,周丽兴.黄皮果核有机溶剂浸提物对稗草光活化生长抑制活性[J].杂草科学,2005(2)：11-13.

[7]万树青,郑大睿.几种植物提取物对萝卜蚜的光活化杀虫活性[J].植物保护,2005,31(6)：55-57.

[8]周琼,梁广文,曾玲,等.多种植物乙醇提取物对桃蚜和萝卜蚜试验种群的控制作用[J].中国农业科学,2002,35(11)：1356-1360.

[9]张方平,刘红芳,罗永强,等.25种热带植物乙醇提取物对比哈小爪螨驱避作用[J].植物保护,2006,32(4)：57-60.

[10]王伟,荣晓东,胡学难,等.几种杀虫剂对榕管蓟马的室内毒力测定[J].广东农业科学,2009,(5)：112-113.

[11]陈年春.农药生物测定技术[M].北京：北京农业大学出版社,1991.

[12]马伏宁,万树青,刘序铭,等.黄皮种子中杀松材线虫成分分离及活性测定[J].华南农业大学学报,2009,30(1)：23-26.