中药对肾小球硬化大鼠MMP-9、TIMP-1及TGF-β1mRNA表达的影响

倪晨 王贵均 王倩 赖小平

肾小球硬化(glomerulosclerosis，GS)是肾小球疾病发展至终末期，肾功能衰竭的主要病理改变。其中细胞外基质(ECM)降解减少、过度积聚，是GS的重要发病机制[1,2]。在ECM降解调控系统中发挥重要作用的是基质金属蛋白酶MMP和基质金属蛋白酶抑制物TIMP[3](MMPs-TIMPs)系统，随着TIMP-1表达增强，MMP-9降解作用减弱，MMP-9/TIMP-1的比值失调，最终形成肾小球硬化。此外，细胞因子在GS的形成过程中也起着非常关键的作用，其中转化生长因子[4]TGF-β1的调控作用尤为重要。TGF-β1既能促进ECM合成增加，又能抑制ECM的降解，最终导致ECM聚积，形成肾小球硬化。本研究基于肾络癥积理论，采用祛瘀化痰、散结消癥的治疗方法，配伍川芎、鳖甲、海藻[6-8]，考察祛瘀化痰、散结消癥中药复方对肾小球硬化大鼠肾功能的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，CO2恒温培养箱(美国harris公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，酶联免疫检测仪(BIORAD smartspec 3000型)，电子精密天平(上海精密科学仪器有限公司)，荧光定量PCR仪(ABI 7300)、Effendorf 冷冻离心机。

1.2 试药

川芎、鳖甲、海藻，购自康美药业股份有限公司。经广州中医药大学中药学院中药鉴定教研室鉴定后使用。称取川芎、鳖甲、海藻各20 g，分别置于1000 ml圆底烧瓶中，以10倍量水回流提取两次，每次1.5小时，滤过，洗涤滤渣，合并两次过滤液和洗涤液，浓缩至1.5 g·ml-1、1.0 g·ml-1、0.5 g·ml-1，分别为高、中、低浓度药液，置于4℃备用。

盐酸阿霉素，浙江海正药业股份有限公司，批号：09015，临用前用生理盐水配制为1 mg·ml-1；福辛普利钠片，施贵宝制药有限公司，批号：H20090262，粉碎后用蒸馏水配制成0.33 g·ml-1的溶液。MMP-9酶联免疫吸附法检测试剂盒、TIMP-1酶联免疫吸附法检测试剂盒(美国RB公司)、First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)。

1.3 动物分组、造模与给药

SD大鼠，60只，雌雄各半，180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供(粤检证字2009A028)。

随机分为空白对照组、模型组、福辛普利钠组、高、中、低浓度中药组等6组，每组10只。各组动物腹腔注射2%戊巴比妥钠30 mg·kg-1麻醉，摘取左肾[5]，空白对照组假手术。

各组动物手术后7天，尾静脉注射阿霉素5 mg·kg-1，20天后再给阿霉素3 mg·kg-1造模，空白对照组注射等体积生理盐水。

各组于第2次注射阿霉素后1天，按1 ml·100g-1·d-1灌胃，空白对照组及模型组给同体积蒸馏水，福辛普利钠组给福辛普利钠，各中药组给相应浓度药液，共给药8周。

1.4 24小时尿蛋白定量检测

各组于第2、4、6、8周结束时收集24小时尿液，溴甲酚氯仿法测定24小时尿蛋白定量。

1.5 MMP-9、TIMP-1检测

各组动物于末次给药1小时后，断头取血，常规方法取血清，另开腹腔取肾脏。

MMP-9的检测：取上述各组血清，按 MMP-9 ELISA试剂盒要求操作，培养板各孔加100 μl Assay Diluent RD1-34，每孔加100 μl标准品、样品，孵育2小时，弃去上清，400 μl Buffer洗液·孔-1，清洗4次，加MMP-9二抗孵育1小时，弃去上清，400 μl Buffer洗液·孔-1，清洗4次。每孔加显色液200 μl，避光室温孵育30 分钟，加终止液终止反应，用酶标仪检测450 nm处的吸光度OD值。

TIMP-1的检测：取上述各组血清，按酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒要求操作，将TIMP-1 McAb分别滴加在培养板孔内，100 μl·孔-1，4℃过夜后弃去上清，用0.05%(V/V)Tween-20PBS(PBST)洗板3次，每次3分钟；拍干后加含15%小牛血清的PBS，200 μl·孔-1，4℃过夜后弃去上清，PBST洗涤3次，每次3分钟。将标准品、样品加于包被孔内，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，拍干后加HRP-抗TIMP-1二抗100 μl·孔-1，37℃孵育30分钟，PBST洗板5次，彻底拍干后加入TMB显色剂，50 μl·孔-1，37℃孵育15分钟，加2 mol H2SO4 50 μl·孔-1终止反应，用酶标仪检测450 nm处的吸光度OD值。

1.6 实时荧光定量PCR检测细胞TGF-β1mRNA

1.6.1 总RNA提取

取100 mg肾脏组织，按试剂盒要求操作，加入TRIzol反复吹打裂解细胞，用氯仿、异丙醇、75%乙醇分离、纯化 RNA，最后用DEPC水溶解，紫外分光光度法检测总RNA浓度及纯度，置于-20℃备用。

1.6.2 逆转录反应

反应体系为20 μl，各组分终浓度分别为dNTP 1 mmol·L-1、Oligo(dT)18引物2.5 nmol·L-1、M-MlV逆转录酶10 U·μl-1、总RNA样品0.2 ng～200 ng，DEPC水加至20 μl；逆转录反应参数为70℃孵育30分钟，冰上放置2分钟，37℃孵育5分钟，42℃孵育60分钟，70℃孵育10分钟，所得产物cDNA用于实时荧光定量PCR。

1.6.3 实时荧光定量PCR

所用的目的基因引物及内参照GAPDH引物均委托 invitrogen 公司合成。引物序列：TGF-β1上游引物5’-tacagggctttcgcttcagt-3’，下游引物5’-gttggtatccagg gctctcc-3’，产物长度 209 bp；GAPDH上游引物5’-ctcccattcctccacctttg-3’，下游引物5’-ccaccaccctgttgctgtag-3’，产物长度 110 bp。反应体系为20 μl：2 μl cDNA，1 μl SYBR Green I 荧光染料，1 mmol dNTP，1μmol·L-1上、下游引物，5U·μl-1Taq酶，DEPC水加至20 μl，混匀。PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸20秒，热循环40次，72℃延伸5分钟。

1.6.4 实时荧光定量PCR数据分析方法

按照2-△△Ct相对定量方法分析，目的基因和参照基因扩增效率都接近100%，具有一致性。△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，△△Ct=△Ct(处理组)-△Ct(空白对照组)，取100倍2-△△Ct数值进行比较。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠24小时尿蛋白定量结果

各中药组均能减少肾小球硬化大鼠24小时尿蛋白(P< 0.05)，见表1。

2.2 各组大鼠MMP-9、TIMP-1表达的比较

各中药组均能有效上调MMP-9的表达，下调TIMP-1的表达，提高MMP-9/ TIMP-1的比值(P< 0.05)，其中中剂量组效果最为显著(P< 0.01)，见表2。

2.3 各组大鼠TGF-β1 mRNA表达的比较

各中药组均能抑制肾小球硬化大鼠TGF-β1mRNA的表达(P< 0.01)；其中以中剂量组效果最显著，见表3，图1。

表1 各组大鼠24小时尿蛋白定量比较

表2 各组大鼠MMP-9、TIMP-1表达的比较

表3 各组大鼠TGF-β1mRNA表达的比较

图1 各组大鼠TGF-β1mRNA表达的比较

3 讨论

细胞外基质ECM的降解过程中发挥重要作用的是MMPs-TIMPs系统，其中，MMP-9可降解ECM中主要成分，减少ECM沉积，而TIMP-1可抑制MMP-9的降解作用，因此，MMP-9表达降低或TIMP-1表达增高，均可使MMP-9/TIMP-1的比值失调，从而加速肾小球硬化的形成。转化生长因子TGF-β1在肾小球硬化的形成过程中也起着非常关键的作用，TGF-β1既能促进ECM合成增加，同时又抑制ECM的降解，最终导致ECM聚积，形成肾小球硬化。因此，本研究观察各药物组对肾小球硬化大鼠MMP-9、TIMP-1、TGF-β1mRNA的表达及MMP-9/TIMP-1比值的调节，评价各组中药对ECM降解调控系统的影响。

中国古代医籍中没有“肾小球硬化”的表述，但根据其发展过程中的临床表现及发病特点，该病可归属于 “水肿”、“虚劳”、“肾劳”、“癃闭”等病症范畴。该病络气郁滞[9]，瘀血痰湿凝滞肾络而致“肾络癥积”，肾脏组织的病理改变，如细胞外基质积聚、血管拌闭塞、球囊粘连、局灶或节段性肾小球硬化等，都可归属于“肾络癥积”的范畴。

本实验采用单侧肾切除加注射阿霉素造模法，建立肾小球硬化大鼠模型，实验表现为蛋白尿和肾功能低下。实验选取福辛普利钠作为肾脏保护的阳性对照组，福辛普利钠属于血管紧张素转换酶抑制剂，通过抑制血管紧张素Ⅱ的生成、阻断肾素—血管紧张素—醛固酮系统作用，及抑制缓激肽降解、增强缓激肽效应；同时可以减少尿蛋白排泄等，拮抗肾小球硬化及肾间质纤维化而延缓肾损害进展。通过川芎、鳖甲、海藻相互配伍，针对肾络之“痰、瘀、癥积”，在祛瘀、化痰的同时，配伍散结消癥之品以增强消癥化积之力，以期“痰瘀同治、癥结并消”。实验结果提示该复方能减少肾小球硬化大鼠24小时尿蛋白(P<0.01)，抑制TIMP-1的表达(P< 0.05)，上调MMP-9活性(P< 0.05)；中剂量组可同时下调TGF-β1mRNA表达(P< 0.01)；可能通过对ECM系统的调控，产生对肾小球硬化大鼠肾功能的保护作用。 综上所述，“肾络癥积”理论指导下的祛瘀化痰、散结消癥中药复方，为中医药临床治疗肾小球硬化，提供新的思路，但仍需进一步研究。

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