壳聚糖及其衍生物的抑菌试验研究

盛贻林，叶舟，陈奇

壳聚糖（chitosan）为几丁质脱乙酰化后的产物，是一种阳离子型多糖，也是目前唯一的商品化碱性多糖，具有无毒、可降解、良好的生物相容性、成膜性及抗菌抑菌等优良特性，在医药卫生、食品等方面得到广泛的应用[1-2]。羧甲基壳聚糖是壳聚糖羧甲基化后的产物，既保留了壳聚糖的优点，又极大地改善了水溶性，因而具有更广泛的用途，在众多的壳聚糖衍生物中倍受关注[3]。

大肠杆菌（Escherichia coli），枯草杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是自然界中普遍存在的细菌，也是食品中常见的细菌，对人体危害较大。目前食品中常用的防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钠等，对人体都具有一定的危害。壳聚糖也可作为食品防腐剂，但是其水溶性不好，限制了它的应用。羧甲基壳聚糖不仅具有防腐性能，而且还具有很好的水溶性[4]。

本文将壳聚糖、羧甲基壳聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用进行比较，以期为壳聚糖及其衍生物在医药和食品领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

壳聚糖和羧甲基壳聚糖购自山东奥康生物科技有限公司；营养琼脂和蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司；牛肉膏购自杭州微生物制剂有限公司。大肠杆菌由金华市药品检验所提供；金黄色葡萄球菌由金华市迪耳药业有限公司提供；枯草芽孢杆菌由中科院微生物研究所提供。

牛津杯内径 6.0mm，外径 7.8mm，高 10.0mm。DGG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱和 SHP-150 恒温生化培养箱购自上海森信实验仪器有限公司；LDZX-50KBS 高压灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；BS-1EA 恒温振荡培养箱购自常州国华电器有限公司；SW-CJ-1F 超净工作台购自苏州净化设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 壳聚糖、羧甲基壳聚糖的抑菌试验 将活化后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至 LB 培养基上，摇床培养 24 h 后，分别制成 5‰、10‰ 浓度的菌液备用。在培养皿内加入灭菌后的营养琼脂，待冷却凝固后分别加入 0.1 ml 5‰、10‰ 的菌液，用涂布器涂布均匀。每个平皿中均匀地放置无菌的牛津杯 3 只。将壳聚糖和羧甲基壳聚糖分别配制成 2.0、5.0、10.0、20.0 mg/ml 浓度的水溶液，用无菌吸管吸取上述不同浓度的壳聚糖和羧甲基壳聚糖溶液 0.25 ml 于牛津杯中。然后放入培养箱中 37℃培养 24 h，观察抑菌圈大小，测量抑菌圈平均直径[5]。

1.2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定 将羧甲基壳聚糖溶液加入牛肉膏蛋白胨培养基中, 使终浓度分别为10.0、5.0、2.0、1.0、0.8、0.5、0.3、0.1 mg/ml，调节 pH 值至 7.0，121℃灭菌 20min。将活化后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液稀释成 5‰，每培养皿各加 0.1 ml，再加 15 ml 冷却至 45℃的培养基，摇匀、冷却后，37℃倒置培养，重复 2 次。以 24 h 后不长菌的浓度为最小抑菌浓度[5]。

1.2.3 不同 pH 值对羧甲基壳聚糖溶液抑菌性能的影响 制备羧甲基壳聚糖含量为5.0 mg/ml 的牛肉膏蛋白胨培养基，用 10%的盐酸或 10%氢氧化钠调节 pH 值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，以不加羧甲基壳聚糖的培养基为对照，121℃灭菌 20min，倒平板，冷却后取 0.1 ml 三种菌悬液接种于相应的培养基上，均匀涂布，重复 2 次。37℃培养 24 h 后菌落计数，计算抑菌率。抑菌率 η =（N0－ N1）/N0（N0、N1分别为对照和加入羧甲基壳聚糖溶液的菌落数）。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 13.0 统计学软件处理数据，数据以±s表示。采用随机区组设计的方差分析和 Student-New man-Keuls 方法进行统计学分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 壳聚糖的抑菌作用

壳聚糖难溶于水，其分散系为悬浊液，基本不能形成抑菌圈，少数在牛津杯的外接圆内也长有菌落，结果见表1。

表1 壳聚糖的抑菌效果

2.2 羧甲基壳聚糖的抑菌作用

羧甲基壳聚糖对三种菌的抑菌作用见表2。经方差齐性检验，显示方差齐。说明羧甲基壳聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌作用，且对三种菌的抑菌作用有显著性差异（P＜0.05），其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，对枯草芽孢杆菌的抑菌作用次之，对大肠杆菌的抑菌作用相对较弱。

表2 羧甲基壳聚糖的抑菌效果（±s）

表2 羧甲基壳聚糖的抑菌效果（±s）

抑菌圈直径（mm）浓度（mg/ml） 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌2.0 15.22±0.12 12.90±0.41 8.10±0.05 5.0 16.24±0.15 13.12±0.07 8.30±0.41 10.0 18.23±0.30 14.22±0.03 9.20±0.22 20.0 20.25±0.13 16.16±0.36 10.24±0.08

2.3 MIC 值的测定结果

试验结果表明，羧甲基壳聚糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌最低抑菌浓度分别为0.5 mg/ml，0.8 mg/ml 和 2.0 mg/ml。由此可知，金黄色葡萄球菌对羧甲基壳聚糖的抑菌作用最为敏感，其次是枯草杆菌，大肠杆菌的敏感性较上述两种细菌相对弱一些。

2.4 pH 值对羧甲基壳聚糖抑菌作用的影响

图1 显示羧甲基壳聚糖在 pH 5.5～6.0 范围内对大肠杆菌有很好的抑制作用，并随着 pH 值的升高而降低。pH＜5.0 时由于环境过酸，未见或少见细菌生长；pH ＞ 6.0 时，羧甲基壳聚糖的抑菌作用明显降低，但仍然有一定的抑制作用。

图2 显示羧甲基壳聚糖在 pH 5.0～6.5 范围内对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用，并随着 pH 值的升高先降低再升高，至 pH 6.5 出现峰值，pH 值超过 6.5 开始明显降低。pH＜5.0 时由于环境过酸，少见细菌生长；pH ＞ 7.0 时，羧甲基壳聚糖的抑菌作用明显降低。

图3 显示羧甲基壳聚糖在 pH 5.5～6.5 范围对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，并随着 pH 值的升高先降低再升高，至 pH 6.0 出现峰值，pH＜4.0 时由于环境过酸，少见细菌生长；pH ＞ 6.5 时，羧甲基壳聚糖的抑菌作用明显降低。

图1 pH 值对羧甲基壳聚糖对大肠杆菌抑菌作用的影响

图2 pH 值对羧甲基壳聚糖对枯草芽孢杆菌抑菌作用的影响

图3 pH 值对羧甲基壳聚糖对金黄色葡萄球菌抑菌作用的影响

3 讨论

壳聚糖由于难溶于水，其分散系为悬浊液，基本不能形成抑菌圈。羧甲基壳聚糖对三种菌都有明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，其次是枯草杆菌，对大肠杆菌的抑菌作用较上述两种细菌相对弱一些。同时羧甲基壳聚糖的 pH 值对三种菌的抑菌作用也有一定的影响。

羧甲基壳聚糖的抑菌作用与氨基和分子大小有关，酸性环境有利于壳聚糖氨基的质子化，质子化壳聚糖进入菌体细胞内，吸附结合一些带负电的细胞质，扰乱菌体细胞的正常生理代谢，从而抑制细菌生长。可见，适当的酸性环境对羧甲基壳聚糖的抑菌作用是必需的。

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