DIGFA-kit和IEST检测人、鼠斯氏狸殖吸虫抗体的研究*

朱名胜,朱 敬,王绍基,宋明华

斯氏狸殖吸虫病(Pagunogonimiasis skrjabini)的病原体为斯氏狸殖吸虫(Pagumogonimus skrjabini),是在中国广泛分布,危害严重的食源性寄生虫病。湖北省十堰市曾在蟹体内查出斯氏狸殖吸虫囊蚴,在猫、犬体内也检出过斯氏狸殖吸虫成虫[1],因当地居民有饮生水和食生蟹的习惯,斯氏肺吸虫病病人时有发现[2]。由于人体为该虫的非正常宿主,感染后导致“幼虫移行症”引起多组织、器官的损害,严重危害其身体健康[3-4],该病临床表现复杂多样,常被误诊、误治。为了探索较简易的血清学诊断方法,作者采用肺吸虫病金标渗滤试剂盒(DIGFA-kit)和免疫酶染色试验(IEST)对流行区人群和斯氏狸殖吸虫感染鼠血清进行特异性抗体检测,比较二者的敏感性和特异性。

1 材料与方法

1.1 试剂盒 肺吸虫病抗体快速检测(金标渗滤法)试剂盒(浙江省医学科学院提供)。

1.2 血清样本 斯氏狸殖吸虫病流行区湖北省十堰市居民血清1 062份,感染斯氏狸殖吸虫90d大鼠血清40份(每鼠感染囊蚴30个),感染旋毛虫50d大鼠血清34份,感染日本血吸虫40d家兔血清30份,蛔虫病人血清28份,健康大鼠血清40份。其中40只实验大鼠感染后每周心脏穿刺取血1次,分离血清备用。

1.3 冰冻切片抗原制备 剖杀经人工感染斯氏狸殖吸虫 3个月的犬,从肺虫囊中收集成虫,用0.01mol/L pH7.4 PBS(含 0.05%Tween20)冲洗后,冰冻切片,厚度 6μ m,每张载玻片裱贴5块抗原片,经丙酮固定后,-20℃保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1 DIGFA 取试剂盒置一平面上,加洗脱液1滴(100μL),使加样孔上 NC 膜湿润;加待检血清25μL,待渗入;加洗脱液 1 滴(100μL),洗去未结合抗体;加胶体金-羊抗人IgG标记物1滴(100μL),待渗入;加洗脱液2滴(200μL),渗入后肉眼判断结果。中央圆孔NC膜上出现了红色圆点为阳性;未出现红色圆点,仅留白色或淡红色背景为阴性。

1.4.2 IEST 将测试血清用0.01mol/L pH7.4 PBS分别作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀释,分别取1滴滴于斯氏狸殖吸虫成虫冰冻切片上,置湿盒中35℃孵育60min,用0.01mol/L pH7.4 PBS洗涤3次,每次5min,吹干。滴加酶标葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA,北京生物制品研究所产品,工作浓度1∶20),同上培育洗涤。再加底物溶液(3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐-过氧化氢),室温反应15～20min,弃底物,用蒸馏水速洗,将湿片置光镜下观察反应。结果判定:抗原片不着色为(-);呈淡棕色为(+);棕色为(++);棕褐色为(+++)。阳性反应标准定为血清稀释度≥1∶10(+)。

2 结 果

2.1 特异性 斯氏狸殖吸虫流行区人群及斯氏狸殖吸虫病鼠血清DIGFA和IEST的阳性检出率均为5.08%和100%,其它对照血清除1例血吸虫病兔DIGFA出现阳性反应外,均为阴性(表1)。

2.2 敏感性 40只大鼠感染后不同时间二种方法检测结果见表2,二种方法感染后第1周血清抗体均为阴性,从第2周开始出现阳性,第4周阳性率达100%,持续至第 8周。

表1 DIGFA和IEST检测血清斯氏狸殖吸虫抗体结果Table 1 Result of detection for antibody test of human in endemic area and animals with different parasitic diseases by DIGFA and IEST

表2 大鼠感染斯氏狸殖吸虫后血清抗体检测结果(DIGFA和IEST)Table 2 Results of detection for antibody in serafrombig rats infected with Pagumogonimus skrjabini

3 讨 论

斯氏狸殖吸虫是一种人兽共患寄生虫,一般在人体内不能发育为成虫,病原学诊断较为困难。免疫学诊断常用的方法主要是皮内试验,皮内试验方便、快速,但具有一定的交叉反应,特异性不强。滴金免疫(金标)渗滤法(DIGFA)是一种新近发展起来的免疫标记技术,近年来报道应用卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwA)金标渗滤试剂盒(DIGFA)检测同源肺吸虫病病人血清抗体敏感性可达98.8%和98.9%,特异性可达93.0%和94.8%[5-6],证明应用于卫氏肺吸虫病流行地区具有敏感性高,特异性强,操作简便、快速,不需要特殊设备等优点,适用于临床检验和现场应用。湖北省十堰地区为斯氏肺吸虫病流行地区,本次用DIGFA和IEST检测流行区居民和病鼠血清抗体,阳性率均为5.08%和100%。表明这两种方法用于斯氏肺吸虫病的检测均具有较好的敏感性和特异性,在斯氏肺吸虫病抗体的检测中,不仅为较好的手段,而且这两种方法彼此间检测结果呈较好的一致性,并均具有早期诊断价值。

李调英等[7]报道卫氏肺吸虫成虫抗原(PwA)和斯氏狸殖吸虫成虫抗原(PsA)对同源及异源肺吸虫病人血清反应都有较好的敏感性和特异性。作者应用PwA抗原制备的DIGFA试剂盒检测斯氏狸殖吸虫病流行地区人群血清,斯氏肺吸虫大鼠血清和其它对照血清,检测结果与IEST试验结果基本一致。说明Pw和Ps有很多共同的特异抗原组份,决定了它们能与异源肺吸虫病人血清IgG有效的特异结合。

实验结果表明,肺吸虫病DIGFA诊断试剂盒和IEST用于斯氏肺吸虫病血清学检测具有简便、快速、敏感性和特异性较好,结果易于判断等优点。因此,在斯氏肺吸虫病流行地区进行临床诊断和流行病学调查时,可选用其中一种方法,作为病原学诊断的替代方法,上述二种血清学试验方法均具有较大的实用价值。

[1]张光玉,郭鄂平.十堰地区肺吸虫病区域分布及流行病学[J].郧阳医学院学报,1997,16(1):23.

[2]朱名胜,朱丹.斯氏肺吸虫病 108例临床报告[J].四川医学,2004,25(12):1321.

[3]郭鄂平,朱洁,张光玉,等.斯氏狸殖吸虫病53例临床资料分析[J].山西医科大学学报,2008,39(2):147-149.

[4]Nakamura-uchiyama F,Onah DN,Naway MV.Clinical features of paragonimiasis cases recently found in Japan:parasite-specific immunogobulin M and G antibody classes[J].Clin Infect Dis,2001,32(2):171-175.

[5]干小仙,施晓华,王越,等.肺吸虫病抗体快速检测试剂盒(金标渗滤法)的研制和应用[J].中国人兽共患病杂志,2005,21(11):988-990.

[6]丁建祖,王越,陈军虎,等.斑点金免疫渗滤法检测肺吸虫抗体的评价[J].中国人兽共患病杂志,2003,19(1):89-90.

[7]李调英,徐亮,曾明安.卫氏和斯氏肺吸虫抗原对同源及异源肺吸虫病诊断价值的比较[J].实用寄生虫病杂志,2000,6(2):86-87.