水稻农杆菌转化体系中共培养方法的优化

马永光，于翠梅，杨 巍，徐振峰

（1.沈阳市农业科学院，辽宁沈阳 110034；2.沈阳农业大学，辽宁沈阳 110161；3.中国种子集团，辽宁沈阳 110034）

共培养从广义上讲是将2种生物在一起培养并使其发生相互作用。该文中的共培养是指用携带目的基因片段的微生物和植物的愈伤组织在一起进行培养，从而使微生物中的目的基因转移到植物愈伤组织中，达到转基因的目的。

农杆菌与外植体共培养常采用固体培养基，也可采用液体培养基，但应用较少。采用固体培养基时，可将外植体直接放在上面培养，也可在培养基上铺1～2层滤纸，然后再放外植体进行共培养。放滤纸可控制外植体上农杆菌的过度增殖。该试验通过对影响农杆菌转化体系共培养的方法进行试验比较，对以往的共培养方法进行了部分优化，并进行了比较。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为水稻品种日本晴。

1.2 供试菌种

农杆菌(A.tumefaciens)采用携带有潮霉素抗性载体pCambial300，根癌农杆菌LBA4404。

1.3 外植体的获得

取饱满、色泽好的水稻种子，去壳，用无菌水简单冲洗2遍后，用70%乙醇杀菌1.5 min，再用含有2.5%的次氯酸钠杀菌15 min，其中每50 mL次氯酸钠含有1滴吐温20，最后再用无菌水清洗5遍。在N6D（加入2,4－D的N6培养基）诱导培养基上进行诱导培养（图1）。将诱导培养10 d左右的愈伤组织有选择地转接到继代培养基上（图2）。采用26℃暗培养，时间控制在7～10 d，可出现大量状态良好的愈伤组织。以后每10 d继代1次，挑选色泽淡黄、质地细腻、柔软的愈伤组织进行共培养。也可在诱导培养基上培养14 d左右，直接选取质量优良的愈伤组织进行共培养。

图1 日本晴2.5%次氯酸钠处理后培养4 d

图2 日本晴诱导培养10 d

1.4 农杆菌的培养

将含有目的基因载体的农杆菌在含有50 mg/L Kanamycin的YM平板上划线，在28℃下暗培养3 d，用一金属匙收集农杆菌菌体（一小撮即可），使之悬浮于AAM培养基中，调整菌体浓度至OD600近似等于0.1，加入AS，使其最终浓度为100 mol/L，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

1.5 外植体与农杆菌的共培养

通常情况下，共培养时都用共培养基培养。该试验在共培养时未采用共培养基，而是利用简单的被0.5 mL AAM培养基浸湿的无菌滤纸，将侵染过后的愈伤组织转移其上进行共培养。共培养时间要精确控制在2～3 d，时间短（共培养2 d以下），农杆菌侵染效果不明显，则有部分愈伤组织未被侵染；共培养时间过长（3 d以上），愈伤组织易大量染菌，转至筛选培养基上培养后，愈伤组织周围会长出大量农杆菌，不利于筛选。

从继代培养上挑选状态较好的愈伤组织，一般是继代培养5～7 d，颗粒分明，色泽淡黄，质地细腻柔软的愈伤组织，放入100 mL无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液（悬浮液的量要保证有足够的菌液与材料相接触），在室温下放置20 min，并不时摇晃或放到摇床上慢摇。再倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余的菌液。然后采取2种不同的共培养方法：①转移到铺有1层无菌滤纸的固体共培养基上(图3a)，28℃暗培养，时间严格控制在2～3 d之间，时间过短浸染效果不明显，时间过长，愈伤组织染菌。②无菌滤纸用0.5 mL AAM培养液浸湿（图3b），铺在培养皿中，然后直接将侵染过后的愈伤组织在其上进行共培养。

2 d后转至筛选培养基培养。筛选培养基采用含有50 mg/L的潮霉素和400 mg/L的羧苄青霉素的N6D培养基，对愈伤组织进行2次筛选，观察2个筛选时间段上的效果和产生抗性愈伤组织的比率。

2 结果与分析

从图3a与图3b比较来看，在共培养阶段，2种共培养方法中愈伤组织并无明显差别。

图3 2种共培养方法的培养效果

筛选阶段是通过药品选择抗性愈伤组织，愈伤组织成功转化在这个阶段就可以体现出来。这时，愈伤组织的生长状态会发生明显变化，非抗性愈伤会死亡，抗性愈伤会重新生长。2次筛选的愈伤组织的状态如图4所示。

图4 2次筛选的愈伤组织

将共培养后的愈伤组织放在含有50 mg/L潮霉素和400 mg/L的羧苄青霉素的筛选培养基上，28℃暗培养14 d，再转到新配制的筛选培养基上继续进行第2次筛选。大部分愈伤组织在筛选10 d左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。

通过培养效果比较及筛选培养过程中抗性愈伤组织的比例（表1）可以看出，采用2种方法共培养转化愈伤组织，在筛选培养过程中都获得了较高频率的抗性愈伤组织。但是直接用滤纸的这种方法简单易行，便于操作，利于控制愈伤组织染菌，客观上利于增加产生抗性愈伤组织的比例。

表1 2种共培养方法下日本晴产生抗性愈伤组织的比率

3 讨论

共培养阶段是农杆菌介导遗传转化的关键时期，农杆菌对愈伤组织的侵染过程，也是农杆菌携带的基因片断向愈伤组织细胞转化的过程。共培养时间一般是2～3 d。通常在这个阶段都将愈伤组织在农杆菌悬浮液中慢摇培养20 min后，吸干菌液，然后放到铺有一层无菌滤纸的共培养基上培养。共培养基的作用是给愈伤组织提供足够的营养。该试验中，直接将悬浮培养后的愈伤组织放在浸有0.5 mL AAM液体培养基的无菌滤纸上培养，取得了更好的效果。

在愈伤组织与农杆菌共培养后，含有目的基因的T-DNA片段已转移至受体细胞，并整合到受体细胞的基因组中，实现了外源基因。此时，农杆菌细胞和受体植物细胞同时增殖生长，而农杆菌的生长繁殖会严重影响受体植物细胞的生长。而直接用吸过农杆菌悬浮液的滤纸进行共培养，其过程时间短，滤纸中AAM液体培养基的营养就可维持愈伤组织的短期生长，同时客观上有效控制了农杆菌繁殖数量，保护了植物细胞，不易出现愈伤组织过度染菌的现象，避免在筛选时加大抗生素用量所带来的不良后果。

这种方法省去了配制固体培养基的大量繁琐的工作，方法简单易于操作，减少了污染机会，能够保障试验顺利有效地进行，同时节省配制培养基的药品，节约试验成本。

利用农杆菌介导法进行水稻转基因时，在共培养阶段用浸有0.5 mL AAM培养液的无菌滤纸直接铺在培养皿中，将侵染过后的愈伤组织在其上进行共培养，既能保证农杆菌侵染植物愈伤组织的质量，又能减少试验污染，节约成本，简便实用。

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