复方血栓通胶囊微生物限度检查法的验证

王淡娜 赵春明

复方血栓通胶囊是国家火炬计划重大项目的成果，是全国为数不多的单品种年销售数亿元的中成药。复方血栓通胶囊由三七、黄芪、丹参、玄参经科学方法提取有效成分制成;功效活血化瘀，益气养阴;用于血瘀兼气阴两虚证的视网膜静脉阻塞、稳定性劳累型心绞痛等。由于功效显著，应用广泛，被载入《中国药典》。复方血栓通胶囊为不含原药粉的口服制剂，微生物限度检查包括细菌、霉菌和酵母菌、控制菌中的大肠埃希菌。为了保证用药安全，确立可靠的微生物限度检验方法，作者按照《中国药典》微生物限度检查方法[1]规定，对该品的微生物限度的检查法进行了验证。现报告如下。

1 实验材料

1.1 仪器及样品 JYT-2架盘天平，LRH-150B型生化培养箱，隔水式电热恒温培养箱，MLS-3750高压蒸汽灭菌器，洁净工作台，三角瓶，培养皿等。

复方血栓通胶囊(广东众生药业股份有限公司100901101001 101201)

1.2 培养基稀释剂及试剂 营养琼脂培养基和对照培养基，玫瑰红钠琼脂培养基和对照培养基，改良马丁培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基和和对照培养基，4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基和对照培养基，麦康凯琼脂培养基和对照培养基，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等，均来源于中国生物制品检定所。

1.3 试验用菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]，白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]，以上菌种均来源于中国生物制品检定所，黑曲霉(Aspermlillus nimler)[CMCC(F)98003]菌种来源于广东省药品检验所。所有菌种均为不超5代的菌株。

2 方法和结果

2.1 细菌、霉菌及酵母菌检查法的验证

2.1.1 菌液的制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18～24 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养24～48 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 ml含菌数约为50～100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5 d，加入5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液，备用。

2.1.2 供试液的制备 取样品10 g，置已灭菌的三角瓶中，分别加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，混合均匀，制成1∶10的样品稀释液。平皿法直接取稀释液为供试液。

2.1.3 培养基的适用性检查 按照《中国药典》(2010版)相关规定检查，培养基上的菌落平均数不小于对照的菌落平均数的70%，形态大小与对照的一致，判定培养基的适用性检查符合规定。

2.1.4 验证方法

2.1.4.1 平皿(常规)法

2.1.4.1.1 试验组 取供试液1 ml和50～100 cfu的试验菌各1 ml，分别注入平皿中立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌数。

2.1.4.1.2 试验菌液组 取已制备好含50～100 cfu的试验菌液各1 ml分别注入平皿中，加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿立即倾注营养琼脂培养基，30～35℃培养3 d，计数;加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基。23～28℃培养5 d，计数。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

2.1.4.1.3 供试品对照组 取供试液1 ml注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基15～20 ml，每种培养基平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

2.1.4.2 培养基稀释法

2.1.4.2.1 试验组 取供试液1 ml分别等量注入五个平皿中，并分别加入50～100 cfu的试验菌各1 ml，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2份，按培养基稀释法测定其菌数。

2.1.4.2.2 试验菌液组 取已制备好含50～100 cfu的试验菌液各1 ml分别注入平皿中，加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿立即倾注营养琼脂培养基，30℃ ～35℃培养3 d，计数;加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基。23℃ ～28℃培养5 d，计数。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

2.1.4.2.3 供试品对照组 取供试液1 ml分别等量注入五个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基15～20 ml，平行制备2份，按平皿法测定其菌数。

2.1.5 回收率计算

2.1.5.1 平皿法检测的结果 金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌试验组的回收率＜70%，表明该产品对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌有抑菌活性作用，细菌检查不适宜采用平皿法，细菌检查应采用其他方法重新验证;其余试验组的回收率＞70%，霉菌及酵母菌检查可采用平皿法。见表1。

2.1.5.2 培养基稀释法检测的结果 大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌试验组的回收率均＞70%，见表2。表明该产品的抑菌活性消除，细菌数检查可采用培养基稀释法。

表1 常规平皿法(1∶10供试液)各试验菌的回收率(cfu，%)

表2 培养基稀释法(1→5)各试验菌的回收率(cfu，%)

2.2 大肠埃希菌(控制菌)检查法的验证

2.2.1 菌液制备 取大肠埃希菌斜面培养基少许，接种5 ml营养肉汤培养基内，置30～35℃培养24 h，取均匀培养物1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 ml含菌数约为10～100 cfu的菌悬液，在2～8℃保存，备用。

2.2.2 大肠埃希菌检查用培养基的适用性检查 按照《中国药典》(2010版)相关规定检查，培养基的促生长能力、抑制能力和指示能力均符合要求，判培养基的适用性检查符合规定

2.2.3 验证方法 试验组:取1:10供试液10 ml和上述含10～100 cfu大肠埃希菌液1 ml;阳性对照组:取含10～100 cfu大肠埃希菌液1 ml;阴性对照组:取0.9%无菌氯化钠溶液10 ml;分别加入盛有100 ml胆盐乳糖增菌液的三角瓶中，培养24 h.分别取上述培养物0.2 ml，分别接种至含5 ml-MUG培养基的试管内，置30～35℃培养，于5 h，24 h在365 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入5滴靛基质试液，观察液面颜色。结果详见表3。从表3可以看出，试验组、阳性对照组均检出大肠埃希菌，阴性对照组为无菌生长。表明常规法检出大肠埃希菌，供试液对大肠埃希菌无抑制作用，阴性供试液对本法无干扰，适用于该产品的大肠埃希菌检查。

表3 大肠埃希菌验证结果

3 讨论

《中国药典》2010版规定微生物限度检查法中细菌数、霉菌和酵母菌数计数验证方法验证的回收率应不低于70%，采用平皿法对复方血栓通胶囊验证时，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌试验组的回收率＜70%，其余试验组的回收率＞70%。即该产品对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌有抑制作用，不适宜采用平皿法检查。在改用培养基稀释法(1→5)后，大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌试验组的回收率均＞70%。因此，检查该品种的细菌数可考虑采用培养基稀释法或其他方法。

[1]国家药典委员会，中国药典一部附录.北京:中国医药科技出版社，2010:79-84.