痛泻要方对内脏高敏感大鼠脑干孤束核CGRP表达的影响

蒋 霞 潘 锋 陈建永 浙江省中西医结合医院消化内科 杭州 310003

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是以腹部疼痛或不适为主，伴有大便性状或排便习惯改变，持续存在或间歇发作，无形态学和生化异常改变的征候群。目前研究表明，50%～70%的IBS患者肠道疼痛阈值低于正常，其肠道处于高敏感状态，而内脏感觉的高敏感性可能与神经调节和传递介质释放失调或感觉神经末梢对这些介质的敏感性增高有关。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）作为神经传递和调节介质，是疼痛感觉及痛觉过敏产生所必需的物质，在调节内脏感觉和运动中起重要作用。吕宾等[1]在内脏高敏感大鼠的脑干多个核团中发现CGRP表达有明显增加。我们应用痛泻要方干预内脏高敏感大鼠，观察其脑干孤束核CGRP表达的变化，以探讨痛泻要方的作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF级雄性Wistar大鼠56只，体重180～200g，清洁级，由浙江中医药大学动物实验中心提供（实验动物生产许可证：SYXK（浙）2008-0115）。所有动物在有恒温、恒湿及昼夜光线变化的房间里分笼饲养，自由进食、进水，适应性饲养1周后开始实验。

1.2 药 物 番泻叶购自浙江省医药公司（杭州桐君堂中药饮片厂）。将番泻叶置60℃烘箱中密封水浸泡12h，纱布过滤浓缩为100%浓度，4℃储存备用。痛泻要方颗粒剂（含白芍、防风、白术各12g，陈皮6g，江苏江阴天江药业有限公司生产）用灭菌蒸馏水按1∶1冲兑，4℃储存备用。将得舒特（通用名：匹维溴铵，法国苏威特制药公司，批号H20070059，50mg/粒）用研钵研细，100目过筛，用灭菌蒸馏水按1∶1冲兑，4℃储存备用。

2 实验方法

2.1 分组及造模 将大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组、对照组，每组14只。适应性喂养1周后，模型组、治疗组、对照组先灌服番泻叶煎剂10g/kg，1天1次，连续2周；2周后加用束缚桶束缚大鼠肩部、前肢及胸部，限制大鼠用前肢搔抓头面部，但不限制其活动，束缚时间为1h，1天1次，连续2周。

2.2 药物干预 自第4周起，模型组予0.15mL生理盐水灌胃，治疗组予0.15g/0.15mL痛泻要方水溶液灌胃，对照组予3mg/0.15mL得舒特水溶液灌胃，连续2周。正常组大鼠同步饲养，予等剂量生理盐水灌胃6周。

2.3 标本采集 第6周末，在25%乌拉坦腹腔麻醉下，开胸，暴露心脏，从左心室插管至升主动脉，经升主动脉用500mL生理盐水灌流冲洗血液，并剪开右心耳，至肝脏完全变白，从右心耳流出无色的冲洗液后，再用新鲜配置的固定液（含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液）500mL灌流，至四肢、脊柱变硬（时间约40min），立即取脑，在上述固定液中固定2～4h（4℃），再移入含30%蔗糖的PB液内直至组织沉淀（4℃），沉淀时间约48h。取出后在大脑脚底做一冠状切面，剥离小脑，将脑干做冰冻连续冠状切片，片厚30μm，隔6取1，收集于三套玻片上，分别做CGRP免疫组化、阴性对照及Nissl染色。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 评估肠道敏感性[2]6周后，采用直结肠扩张刺激的方法观察大鼠腹部回缩反射。每组随机选取6只大鼠，乙醚麻醉下，用石蜡油润滑后的动脉栓子清除术导管经肛门插入，气囊末端距离肛门1cm，用胶布把导管和鼠尾根部缠在一起以固定气囊，将大鼠放入只能前后运动的透明笼中，待大鼠适应环境后，向囊内逐渐注水扩张肠道，观察大鼠腹部抬高（3分）及背部拱起（4分）时的容量阈值，进行评估。为得到准确数据，每次操作重复3次，数据取平均值。

腹部回缩反射（Abdominalwithdrawal reflex，AWR）行为评分标准为：0分，大鼠情绪基本稳定，无行为学反应；1分，大鼠情绪不稳定，扭动头部；2分，大鼠腹背部肌肉轻微收缩，但腹部未抬离地面；3分，大鼠腹背部肌肉较强收缩，腹部抬离地面；4分，大鼠腹背部肌肉强烈收缩，背部呈弓形并把腹部、骨盆及会阴部抬离地面。1分看作是大鼠的感觉容量阈值，2分作为痛觉敏感阈值，4分作为痛觉最大耐受容量阈值。观察大鼠达到3分和4分行为标准时的注水量，通过注水量反应其肠道的敏感性，肠道敏感性越高，达到3分、4分行为标准者注水量越少。

2.4.2 评估腹壁紧张度 每组随机选取6只大鼠，用苯巴比妥（30mg/kg）麻醉，将一银制双极电极缝合到腹股沟韧带上方、距中线1.5cm的一侧腹外斜肌上。电极的游离端经皮下隧道置于颈后，用胶布固定。手术后5天开始肌电记录。乙醚麻醉下，将上述球囊导管经肛门插入直肠内，球囊末端距离肛门1cm，电极导线的两端连接电生理记录仪。大鼠苏醒30min后，分别在 0、0.5、0.8、1.6mL 容量下进行直肠扩张。每次膨胀持续5min，记录5min内腹壁收缩数量，每次扩张结束时，将水回抽，检测球囊有无漏水。用PowerLab电生理记录仪记录腹壁肌电活动，高频滤过设置为10Hz，低频滤过为1kHz，电压1mV。肌电活动增高超过基线水平100μV以上认为是1次有意义的腹壁收缩活动。

2.4.3 免疫组化ABC法 大脑片经0.3%H2O2的甲醛溶液处理30min，然后用0.01%mol/L的PBS洗涤4次，加入抗体稀释液37℃恒温箱中孵育1h，再加1：2000 兔抗鼠 CGRP（购自 Sigma公司 c8198），4℃冰箱72h，PBS洗涤4次，加1：200的生物素化羊抗兔抗体（购自sigma公司B7389），4℃冰箱48h，PBS洗涤4次，加1：200链霉亲和素－辣根过氧化物酶复合物（购自 sigma公司 PK-4000），4℃冰箱 24h，PBS洗涤4次，室温（20℃左右）下加 DAB 显色 10～15min，PBS洗涤中止反应，室温下干燥，85%、90%、95%、100%、100%、100%酒精上行逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。用PBS代替一抗，进行空白对照，同步进行上述免疫组化染色，结果为阴性。

Nikon ECLIPSE E-600电子显微镜观察，在目镜上放置正方形网格，记录镜下（10×40倍）一个网格所覆盖面积下的阳性细胞数，折算成每平方毫米的阳性细胞数，并照相。

2.5 统计学方法 各核团单位面积CGRP阳性细胞数结果以（） 表示。应用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Tambane’S T2法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大体观察 正常组大鼠体重明显增加，大便正常，耗食量正常。其余各组大鼠均出现不同程度体重增长缓慢或下降：治疗组大鼠于第2～3天开始出现烦躁、大便次数增多、大便水分增多；对照组大鼠第2天开始出现大便次数增多、稀便、肛门口污秽、拱背、萎靡、蜷卧少动、喜聚堆等表现；模型组大鼠兼有以上两组表现，大便完全为稀便，大鼠嗜卧扎堆，毛色无华、变脆。

3.2 各组大鼠肠道敏感性和腹壁紧张度比较 正常组、治疗组、对照组大鼠腹部回缩反射直肠扩张容量比较差异无统计学意义（P＞0.05），但与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。不同直肠扩张强度下大鼠腹壁收缩次数比较见表2。

表1 各组大鼠腹部回缩反射直肠扩张容量比较（） mL

表1 各组大鼠腹部回缩反射直肠扩张容量比较（） mL

注：与模型组比较，△P＜0.05。

组 别 n/只 腹部抬高 背部拱起正常组 6 0.65±0.09△ 1.04±0.12△模型组 6 0.42±0.05 0.60±0.04治疗组 6 0.70±0.06△ 1.06±0.18△对照组 6 0.68±0.08△ 1.05±0.07△

表2 不同直肠扩张强度下大鼠腹壁收缩次数比较（） 次/5min

表2 不同直肠扩张强度下大鼠腹壁收缩次数比较（） 次/5min

注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组 别 n/只 0.5mL 0.8mL 1.6mL正常组 6 0.63±0.02△ 3.67±1.32△△ 15.90±4.23模型组 6 5.63±0.16 9.10±1.35 17.60±3.76治疗组 6 0.63±0.03△ 4.23±1.46△△ 16.78±4.12对照组 6 0.65±0.02△ 4.45±1.31△△ 16.45±4.28

3.3 免疫组化结果 典型的CGRP免疫阳性神经元表现为胞浆染色呈棕褐色，胞核不着色，神经元呈现空泡状。每组大鼠脑干孤束核均表达CGRP免疫阳性神经元，呈双侧分布，组间表达有差异。正常组、模型组、治疗组、对照组四组大鼠脑干CGRP免疫阳性神经元个数分别为 83.87±9.54 个/mm2、125.89±14.93个/mm2、97.18±12.49 个/mm2、91.52±10.76 个/mm2。正常组、治疗组、对照组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

电镜下各组大鼠孤束核CGRP表达见图1～4。

4 讨 论

已有研究[3]发现，CGRP与痛觉信号的传递有密切关系，脊髓蛛网膜下腔注射CGRP可使痛阈降低，它可以通过促进SP的释放而有利于痛觉的传递。在甲醛致痛实验中，发现投射到脊髓背角浅层的初级传入神经末梢中的CGRP样免疫活性物质明显增多；佐剂性关节炎痛时，脊髓背根神经节（DRG）神经元内CGRP-mRNA表达明显增强；镇痛药可使DRG内CGRP免疫活性物质含量和脊髓内释放CGRP明显减少，并可使痛觉过敏程度减轻[4]，上述实验均提示CGRP参与了痛觉信息的传递及痛觉过敏的形成。我们既往研究发现[1]，CGRP在内脏高敏感大鼠脑干多个核团的表达增加，尤其是孤束核的表达明显增加，提示高级神经中枢可以通过调控CGRP在脑干核团的表达参与痛觉过敏的形成。

孤束核是一个位于延髓背侧，包绕于孤束周围的Y字形柱状核团，它有广泛的传入传出联系，是内脏的初级传入及调节中枢，与胃肠道活动的调节以及镇痛等多种功能有关。孤束核的上端能够接受来自味觉的初级感觉纤维，其余各部分则接受来自脏器和心血管等的初级感觉纤维，这些纤维进入核团以前在脑干内形成纵行的孤束，孤束核的细胞分布于孤束周围并接受其纤维的终止，直接参与调控内脏活动。另外，作为中转站，孤束核的上行传递系统既能传入大脑皮质，又能间接联系边缘系统，通过更高级别中枢神经系统参与内脏运动。

本实验显示，经过灌服番泻叶煎剂加束缚桶限制活动后，大鼠的痛阈明显降低，直肠注水量明显减少，在孤束核CGRP的表达明显增多，其肠道的敏感性增加，而经过痛泻要方灌胃后的大鼠痛阈明显上升，孤束核CGRP表达明显减少，肠道敏感性下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与正常对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。提示痛泻要方可能通过减少高级神经中枢孤束核CGRP的表达而发挥减轻痛觉过敏的作用。

本组结果显示，孤束核作为内脏感觉刺激传入通路的终止处以及中转站，参与了疼痛刺激信息的传递及调控，痛泻要方可以减轻内脏敏感性，减少大鼠痛觉过敏的形成，而降低孤束核CGRP的表达可能是其作用机制之一。

［1］吕宾，蒋霞.内脏高敏感大鼠脑干降钙素基因相关肽、c-fos基因表达的研究［J］.胃肠病学，2007，12（11）：681-684.

［2］刘雁冰，袁耀宗.大鼠肠道高敏性模型的建立及其内脏敏感性评估［J］.中华消化杂志，2003，23（1）:34-37.

［3］Christensen MD，Hulsebosch CE.Spinnal cord injury and anti NGF treatment results in changes in CGRP density and distribution in the dorsal horm in the rat［J］.Exp Neurol，1997，147（2）：463-475.

［4］Ballet S，Aubel B，Mauborgne A，et al.The novel analgesic，cizolirtine，inhibits the spinal release of substance P and CGRP in rats［J］.Neuropharmacology，2001，40（4）:578-589.