Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受体Flt-1在结直肠癌中的表达及临床意义

陈中皓 王学志 徐铭 杨华 黄忠华

上海市长宁区中心医院胃肠外科，*病理科，▲化验科，上海 200336

结直肠癌是人类常见恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤死亡原因的第二位，近年来发病率呈明显上升趋势［1］。侵袭转移是恶性肿瘤最重要，也是最本质的生物学特征，临床上主要采用以手术为主的综合治疗，但效果并不理想，其主要原因是肿瘤局部的复发和转移。近年来的研究表明，多种生物学指标与结直肠癌发生、发展以及手术后的复发转移和预后有关。我们采用免疫组化方法检测Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受体Flt-1基因在结直肠癌组织中的表达，并探讨其与结直肠癌临床病理因素的关系及其临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2002年6月—2004年1月我院手术切除的原发性结直肠癌患者标本72例，所有患者术前均未接受放疗、化疗及其他针对肿瘤的特殊治疗。有结直肠癌家族史者不纳入本研究。其中，男性45例，女性27例；年龄33～85岁，中位年龄54岁。根据2009年国际抗癌联盟第七版恶性肿瘤TNM分期进行临床分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期19例，Ⅲ期30例，Ⅳ期11例。病理分级：高、中、低分化分别为18例、30例、24例。取所有肿瘤切除标本切端非癌组织(距癌＞5 cm)作为正常对照。复发转移病例经病理、CT、B超、X光检查4项中至少1项证实。

1.2 随访

术后第1年每3个月随访1次，以后每6个月随访1次，随访截止时间为2009年2月， 中位随访时间52个月(8～78个月)。本组共5例失访，随访率为93.1%。

1.3 免疫组化方法

鼠抗人Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受体Flt-1单克隆抗体和SP试剂盒由美国Santa Cruz公司生产，将入选病例的原发灶病理蜡块进行常规切片，制成4 μm厚的切片，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复，SP免疫组化染色。染色步骤严格按照说明书进行，DAB显色，苏木精复染细胞核，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断

细胞膜和(或)细胞质出现棕黄色细颗粒为阳性细胞，判断采用半定量积分法［2-3］，记数5个高倍视野，将平均阳性细胞率分为5类：0分＜5%；1分5%～＜25%；2分25%～＜50%；3分50%～＜75%；4分≥75%。根据阳性染色强度分为4类：无着色0分；淡黄色1分；黄色2分；棕黄色3分；两者积分相加，按积分高低分为：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。包括弱阳性、阳性、强阳性均定义为阳性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，采用χ2检验对数据进行统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 术后复发转移情况

全组总的术后复发转移率为27.8%(20/72)，局部复发率为8.3%(6/72)，远处转移率为19.4%(14/72)。术后复发转移的中位时间为12个月(6～46个月)，术后复发转移在2年内出现者占70.0%(14/20)，在3年内出现者占85.0%(17/20)。

2.2 Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受体Flt-1在结直肠癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达

该5个分子阳性染色主要定位于细胞质中(图1)。在结直肠癌中表达的阳性率分别为62.5%(45/72)、66.7%(48/72)、55.5%(40/72)、61.1%(44/72)、79.2%(57/72)。结直肠癌组织与对照非癌组织中表达差异均有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受体Flt-1在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征及预后的关系

Survivin表达与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、术后复发转移有关；MMP-2表达与淋巴结转移、TNM分期、术后复发转移有关；nm23-H1表达与淋巴结转移、TNM分期相关；VEGF表达与浸润深度、TNM分期、术后复发转移有关；而受体Flt-1表达与临床病理及预后因素均无关。

3 讨 论

Survivin属凋亡家族(IAP)的成员，又称生存素，全长15 kb，位于染色体17q75。通常Survivin仅在胚胎和胸腺中有微弱表达，但Survivin在几乎所有的人类癌组织中都有表达［4］。Survivin可能主要通过2条途径来抑制细胞凋亡：⑴直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3和Caspase-7的活性来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程; ⑵Survivin与周期蛋白激酶CDK4、CDK2相互作用阻断凋亡信号转导通路［5］。Kawasaki等［2］报道，Survivin在结直肠癌的表达阳性率为53.2%，而癌旁正常组织则无Survivin表达。本组研究显示，Survivin在结直肠癌组织中的表达阳性率为63.0%，与对照非癌组织中表达阳性率(12.5%)相比，差异有统计学意义。并且Survivin在结直肠癌组织中的表达与肿瘤浸润深度(P＜0.01)、淋巴结转移(P＜0.01)及TNM分期(P＜0.05)相关，说明Survivin在结直肠癌的发生、发展及转移中起着重要作用。另外，本组研究显示，Survivin在结直肠癌组织中的表达与肿瘤复发转移(P＜0.05)呈正相关，提示Survivin阳性表达可能提示预后不良。

基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质的主要家族之一。它们在肿瘤浸润转移中扮演着重要角色，MMPs通过降解细胞外基质中的大分子物质(如胶原、层黏连蛋白等)而破坏癌细胞浸润的物理屏障。MMP-2是MMPs家族中分布最广的成员，因其主要反应底物为细胞外基质中的Ⅳ型胶原故又称之为Ⅳ型胶原酶［6］。当细胞恶变时常有MMP-2的升高，在多种恶性肿瘤细胞中均发现MMP-2表达的增高，在部分肿瘤中还发现随着肿瘤恶性程度的增高，MMP-2的表达也增高，且与肿瘤的浸润和转移相关［7-8］。本研究中，MMP-2在结直肠癌中的表达与年龄、性别、分化程度和浸润深度均无相关性，与淋巴结转移、TNM分期、复发转移相关(P＜0.01)。可见，MMP-2在结直肠癌的侵袭转移中起着重要作用，并且是恶性侵袭性肿瘤的一个敏感指标。

nm23-H1基因是1988年Steeg等［9］从鼠K-1735黑色素瘤的具有不同转移潜力的细胞系中分离出来的。nm23-H1基因定位于17q21.3，该基因全长约10 kb， 编码一种相对分子质量约为17×103的蛋白质，具有二磷酸核苷激酶(NDPK)活性，NDPK的生物学功能是参与体内三磷酸核生成，通过影响微管聚合状态及G蛋白介导信号传导通路，而调节细胞代谢，从而对肿瘤增殖、分化、侵袭及转移起重要作用［9-12］。Leone等［13］首先报道约22%结肠癌中有nm23等位基因缺失。Berney等［14］研究认为nm23-H1既具有结直肠肿瘤转移抑制功能，并与肿瘤浸润发展呈负相关。本研究结果与之基本一致，nm23-H1表达与淋巴结转移及肿瘤TNM分期呈负相关，而与患者年龄、性别、肿瘤分化、浸润深度等无关。由此可见，nm23-H1基因突变或表达异常是结直肠癌发展中的重要事件，可作为提示肿瘤淋巴结转移的1项指标。

VEGF是最重要的血管生成因子之一，又称血管通透因子。VEGF基因位于6p21.3，全长14 kb，由8个外显子，7个内含子组成［15］。VEGF具有促血管形成，增加血管通透性的双重功能，在创伤愈合、胚胎期血管形成及肿瘤的发展和转移等方面均起着重要作用，对肿瘤血管基质形成及肿瘤生物学行为均有重要影响，可作为肿瘤代谢及转移的标志。本研究结果显示：VEGF表达在结直肠癌组织明显高于对照正常组织，并且与肿瘤浸润深度、TNM分期、肿瘤复发转移相关，提示VEGF在结直肠癌发生、发展中起重要作用，并可作为结直肠癌预后判断的指标。

Flt-1是血管内皮生长因子受体家族中的成员之一，他主要在血管内皮细胞内表达，通常情况下Flt-1呈低表达，仅用于维持正常的微血管密度、基本渗透功能，以利于营养物质代谢。Flt-1激活后具有调节内皮细胞之间以及内皮细胞与基底膜之间的相互作用，能促进血管腔的形成。本研究显示Flt-1在结直肠癌组织中的表达率明显高于对照组，却与年龄、性别、分化程度、浸润深度、TNM分期及预后均无相关性。

总之，结直肠癌的发生、发展是个复杂的多基因参与的多步骤过程，Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受体Flt-1在结直肠癌的发生中起着重要的作用，可能与肿瘤恶性转化及进展转移过程有关。联合检测多个相关分子在结直肠癌中的表达将有助于判断肿瘤的生物学特征和预后，并为进一步基因诊断及分子靶向治疗提供分子依据。

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