猪链球菌2型荧光PCR检测方法与常规检测方法的比较

宋 立，高志强，杨承槐，宁宜宝，张鹤晓，吴 丹，张利峰，刘 洋

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.北京出入境检验检疫局，北京 100026)

目前临床常用检测猪链球菌的方法有细菌分离培养和PCR方法［1］。细菌分离培养是传统的诊断、检测方法，所需时间较长，鉴定相对有一定难度。常规PCR方法不能定量，敏感性不够高。荧光PCR技术是20世纪90年代末发展起来的分子生物学检测新技术，其原理是将荧光基团加入PCR反应体系，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，并能通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析。由于该项技术克服了常规PCR不能定量检测的缺点，且特异性和敏感性较常规PCR大幅提高，因此在医学和兽医领域均得到广泛运用［2－4］。

致病性猪链球菌2型为人畜共患传染病病原菌，在动物中可引起猪的脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和败血症等。该病原致病性强、传播迅速，如果不及时治疗，可导致发病动物急性死亡。猪链球菌病在我国各地时有发生，在局部地区呈暴发势态［5－6］，并常有感染人类的报道［7－8］，给人类健康带来威胁。因此，选择一种快速、灵敏的检测方法用于临床样品检测，及时发现带菌食品和动物，对于猪链球菌病的及时预防和畜产品进出口检验检疫均有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

1.1.1.1 猪链球菌2型R735 由加拿大特利尔大学Marcelo Gottschalk教授惠赠，试验浓度CFU为42 ×106/0.1 mL。

1.1.1.2 猪链球菌2型C55606 从中国兽医药品监察所菌种中心领取，试验浓度CFU为52×106/0.1 mL。

1.1.1.3 猪链球菌四川株 中国兽医药品监察所2005年从四川猪链球菌2型发病猪体内分离，经API Strep拭条鉴定为猪链球菌2型。

1.1.2 试验小鼠和猪 小鼠为1月龄小白鼠，由中国兽医药品监察所基础保障室提供。猪为广东永顺生物制药有限公司动物场饲养的二元长白(♂)与香猪(♀)的杂交一代，均为45日龄，体重20 kg。

1.2 方法

1.2.1 对临床样品检测的敏感性和实用性比较

1.2.1.1 对发病小鼠样品的检测 用猪链球菌2型四川株马丁肉汤20 h新鲜培养物，腹腔注射1月龄小鼠，每只1 mL，约3800个菌，攻菌后2 d死亡2/5。无菌取出死亡小鼠肝脏，与阴性对照小鼠肝脏一同用荧光PCR检测方法和常规细菌分离法检测病原，比较两种方法的敏感性和实用性。

1.2.1.2 对发病猪样品的检测 用猪链球菌2型HA9801株(广东永顺生物制药有限公司制备，疫苗检验用强毒株)攻击试验用猪4头(1#、2#、3#和4#)，每头1.74 ×107CFU。1#和2#猪感染濒死后，马上剖杀取脏器;3#猪攻毒后48 h死亡，死亡后24 h剖杀取脏器;4#猪攻菌后66 h死亡，死亡后6 h解剖取脏器。用荧光PCR检测方法、常规PCR方法和细菌分离法对感染猪的脏器(心、肝、脾、肾、扁桃体实质脏器和血液、喉拭子)进行检测，并设阴性对照，比较3种方法对临床样品的敏感性和实用性。1.2.1.3 荧光PCR检测方法 用北京出入境检验检疫局和中国兽医药品监察所制备的猪链球菌荧光PCR检测试剂盒，批号为2005002，按使用说明书操作步骤进行。

1.2.1.4 常规细菌分离法 首先将样品分别接种于绵羊血琼脂平板，37℃培养40 h，长出的可疑菌落用猪链球菌2型阳性血清进行平板凝集试验，能被特异性阳性血清凝集的为阳性，不能被凝集的为阴性。

1.2.1.5 普通PCR检测方法 上游引物Cps2J－s，5’－ GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T －3’;下游引物Cps2J－as，5’－CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C－3’。目的片段长度为450 bp左右。

1.2.2 检测灵敏度的比较 将猪链球菌2型R735、猪链球菌2型 C55606分别稀释至10－9，用荧光PCR和常规PCR方法进行检测，并做细菌CFU测定，比较检测灵敏度。

2 结果

2.1 荧光PCR检测结果的判定 Ct值≤35.0，且扩增曲线出现特异性指数扩增区，则为猪链球菌2型阳性;无Ct值或无特异性指数扩增区，则为猪链球菌2型检测阴性(图1)。

图1 猪链球菌2型荧光PCR检测示意图

2.2 PCR检测结果的判定 电泳出现450 bp左右条带的判为阳性，否则为阴性(图2)。

图2 猪链球菌2型PCR检测示意图

2.3 对发病小鼠样品检测结果的比较 2只发病小鼠肝脏组织荧光PCR检测呈阳性，而对照呈阴性。与常规细菌分离法检测结果一致。

2.4 对发病猪样品检测结果的比较 用细菌分离法对1#～4#猪细菌分离结果如表1所示。病死后立即取出的病料样品，细菌分离法检出率为100%;死亡数小时后才取出的病料样品，细菌分离率大幅下降。3种方法对2#～4#猪病料的检测结果如表2所示。结果表明对于病死后不同时间采到的病料样品，荧光PCR方法的检测率最高，为70.8%(17/24)，其次是细菌分离法45.8%(11/24)，常规PCR方法检出率最低，为20.8%(5/24)。

2.5 灵敏度检测结果的比较 将 10－5、10－6、10－7和10－8每个稀释度取0.1 mL接种于血平板，37℃培养40 h后进行细菌计数，计算CFU。结果R735株CFU为42×106/0.1 mL;C55606株CFU为52×106/0.1 mL。荧光 PCR 检测滴度可达 10－6，而普通PCR仅能达到10－4。

表1 1#～4#猪病料细菌分离结果

表2 3种方法对2#～4#猪病料的检测结果

3 分析与讨论

3.1 从常规的细菌分离法来看，1#和2#猪死亡后及时采样，血液以及其他实质器官和喉拭子均长出α溶血的链球菌可疑菌落，长菌量排列依次为血→肺和脾→肝和扁桃体→喉拭子→心和肾，用特异性阳性血清鉴定，均为猪链球菌2型。但在细菌培养过程中，除血外，其他样品还长出少量杂菌，表明临床样品通常存在其他细菌的污染。3#和4#猪攻菌死亡后未及时采样，心、脾、肾、肺、扁桃体和喉拭子以长出浅绿色、湿润、圆形、中等大小菌落为主，有β溶血环，经革兰氏染色镜检，菌落为G－杆菌，初步判断为绿脓杆菌。由于该菌生长速度快，几乎覆盖了猪链球菌的生长。只有4#猪血液能长出一些α溶血的被检菌落，肝和肺见到少量被检菌。该试验充分说明传统细菌分离法操作繁琐、耗费时间较长，对被检样品纯净度要求较高，污染杂菌则检出率会大幅下降，但临床样品很难做到不受其他细菌的污染。

3.2 从表2的检测结果来看，猪链球菌2型荧光PCR检测方法具有显著的优点。24份临床感染猪器官样品，该方法检出率为70.8%，普通PCR法检出率仅为20.8%，所以该方法敏感性高于普通PCR方法。常规细菌分离法为公认的标准检测方法，检出率也只为45.8%，主要由于临床样品受其他细菌污染，生长较快的杂菌很快把猪链球菌覆盖。用荧光PCR检测方法，几乎不受杂菌污染的限制，所以荧光PCR这一新型的检测技术，是在普通PCR原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针，在仪器上通过对荧光信号累计的感应和信息处理，使抗原核酸呈特异性S型扩增曲线表示出来，使其在普通PCR基础上，大大增强了对病原体检测的特异性、敏感性和灵敏度，并能定量分析。在样品带菌状况监测和进出口检验检疫中，该方法快速、灵敏、操作方便，完全可以取代常规细菌分离法。但该方法只能做病原核酸的检测，如需分离病原做进一步调查研究，就必须采用经典的细菌分离法。

3.3 对于猪链球菌2型实验室培养的菌液，荧光PCR检测方法的灵敏度也明显高于常规PCR方法，荧光PCR检测滴度可达10－6/0.1 mL(42～52 CFU/0.1 mL);而普通PCR仅能达到10－4。

致谢:广东永顺生物制药有限公司为本试验提供了阳性猪和阴性猪样品，在此感谢王少英总工的无私帮助和支持。

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