四君子汤提取工艺优化研究

2011-05-29张挪威万长荣闫秋会朱晓宇徐霄龙许剑琴

中国兽药杂志 2011年6期

张挪威，万长荣，赵宏，闫秋会，朱晓宇，徐霄龙，许剑琴

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193;2.北京农学院动物科技系，北京 102206;3.农业部兽用化药和中草药创制与评价重点开放实验室，北京 100193)

四君子汤源于宋代《太平惠民和剂局方》，由党参(原方为人参)、白术、茯苓(去皮)、甘草(炙)四味基本中草药组成，主治脾胃气虚［1］。研究结果证实四君子汤具有诱导裸小鼠移植性人胃癌细胞凋亡和抑制胃癌细胞生长的作用［2－3］，可以通过调节小肠细胞因子的表达改善利血平诱导的脾虚大鼠黏膜免疫功能［4］和脾虚状态下对药物的吸收［5］。四君子汤总多糖和四君子汤去蛋白多糖可改善环磷酰胺诱导的免疫功能抑制、促进肠道黏膜免疫功能恢复［6］，在促进胃肠黏膜损伤修复方面也有一定的作用。目前关于四君子汤最优水提工艺的研究还缺少详细报道。为建立科学合理的提取工艺，进一步推动四君子汤的临床应用开发，本研究根据处方中药材有效成分的理化性质和药理作用，以四君子汤中主要药效成分之一甘草酸的提取量为考察指标，采用L9(34)正交试验对药物浸泡时间、加水量、煎煮时间和煎煮次数加以考察，对四君子汤的水提工艺进行了优化研究。

1 材料和方法

1.1 实验器材

1.1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.1.2 试剂甘草酸单铵盐标准品(中国药品生物制品检定所，批号110731－200615);党参、白术、茯苓和甘草(炙)购于北京同仁堂药店，经鉴定为《中国药典》收载品种;甲醇、醋酸铵、冰醋酸为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 正交实验设计

1.2.1.1 因素水平的选择本处方选取浸泡时间、加水量、煎煮时间及煎煮次数作为考察因素，各因素取3个水平(表1)，按照L9(34)正交试验设计筛选最佳工艺条件。

表1 正交实验设计筛选四君子汤煎煮工艺

1.2.1.2 正交试验样品制备党参、白术、茯苓和甘草按照2∶2∶2∶1的质量比称取后混合，按照表2正交试验设计方案水煎提取，提取液混合后真空抽滤和放冷，置200 mL量瓶中备用。

1.2.2 甘草酸单铵盐的测定

1.2.2.1 色谱条件色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测器Serial No:DE64262691，甲醇－1% 醋酸铵溶液－冰醋酸(64∶36∶1)为流动相，检测波长为250 nm，检测理论板数不低于3000。

1.2.2.2 标准品溶液的制备精密称取甘草酸单铵盐标准品适量，用流动相制成每1 mL分别含0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg 甘草酸单铵盐溶液，0.22 μm孔径过滤，即得。

1.2.2.3 供试品溶液的制备精密量取各步正交试验所煎煮的四君子汤5 mL，加入等体积的双蒸水稀释，摇匀，0.22 μm 孔径滤过，即得。

1.2.2.4 标准曲线的制备分别精密吸取不同浓度的甘草酸单铵盐标准品溶液进行测定，标准品溶液进样量为 10 μL，流动相流速 1 mL/min，柱温25℃，检测时间13 min，检测信号波长250 nm。按1.2.2.1项下色谱条件分别注入液相色谱仪，测定其峰面积，以进样样品对应甘草酸单铵盐质量为横坐标(X)，以甘草酸单铵盐峰面积为纵坐标(Y)，得线性回归方程Y=9.38+699.66X，相关系数R=1。

1.2.2.5 精密度实验精密吸取甘草酸单铵盐标准品溶液 10 μL(浓度为 0.1959 mg/mL)，按1.2.2.1项下色谱条件连续进样5次，测定峰面积。RSD=0.47%，表明仪器精密度良好。

1.2.2.6 稳定性实验将同一甘草酸单铵盐标准品溶液分别于 0、3、6、10 h 进样 10 μL，测定峰面积。RSD=1.17%，表明标准品溶液稳定性良好。

1.2.2.7 重复性试验取同一批四君子汤煎剂5份，按 1.2.2.3 项中的方法制备供试品溶液，按1.2.2.1项中的色谱条件进行HPLC分析，计算甘草酸单铵盐提取量。RSD=1.69%，表明重复性良好。1.2.2.8 实验样品和阴性对照品的测定分别精密吸取甘草酸单铵盐标准品溶液、供试品溶液各10 μL注入色谱仪测定，并根据1.2.2.4项中的标准曲线线性回归方程求甘草酸单铵盐提取量，结果如表2所示。

1.2.3 验证实验按基本处方称取党参等药材3批，对上述正交试验所得提取工艺条件进行验证，即按第2水平制备四君子汤煎剂3批，测定煎剂中甘草酸单铵盐提取量。结果表明，最佳煎煮条件可靠，方法可重复操作。

2 结果及分析

2.1 实验结果取9份正交设计实验样品分别测定甘草酸单铵盐提取量。在实验色谱条件下，标准品溶液中甘草酸单铵盐出峰时间在7.25 min左右，与样品(图1)能达到基线分离，没有干扰。各正交水平实验中四君子汤甘草酸单铵盐提取结果如表2、表3和图1所示。验证试验结果如表4所示。

表2 正交实验结果

图1 甘草酸单铵盐高效液相色谱图

2.2 结果分析采用SPSS 12.0统计软件对结果进行数据处理，综合直观分析和方差分析判断各因素对提取效果的影响程度，筛选出在该试验条件下的优化提取参数(表3)。根据正交实验结果可知(表4)，以甘草酸单铵盐为评价指标，各因素的影响顺序为煎煮次数＞煎煮时间＞用水剂量＞浸泡时间，其中煎煮次数对工艺有显著影响，其他3个因素均无显著影响，因此煎煮次数为3。而对于无显著影响的因素，只需结合具体工作及生产实际要求，本着尽量选择平均数最大的水平，最终确定为煎煮时间2 h，加10倍水，浸泡30 min。

表3 正交实验结果分析表

表4 正交实验结果计算表

3 讨论

提取工艺对药品的安全性和有效性有着重要影响，工艺优化评价标准一般应以有效成分和已知成分为主要指标［7］。对四君子汤研究有人以提取物中人参皂苷Rg1的含量为评价指标［8］，也有以四君子汤中其他活性成分如人参总皂甙和总多糖为指标［9］。《中国药典》把甘草酸的量作为评价甘草药材及其制品质量的重要指标，通常要求不低于2%［12］，现有研究已发现了160多种甘草黄酮类化合物［10］，其中有60多种含有三萜类化合物以及香豆素类、氨基酸、雌性激素、有机酸等多种成分［11］。甘草酸(亦称甘草甜素，Glycyrrhizin)是甘草中最重要的三萜类化合物，含量可达 3.63% ～13.06%［13］，亦为其主要活性成分，本实验选择甘草的稳定成分之一甘草酸单铵盐作为测定指标。有人研究煎煮时间对四君子汤某些成分的影响，指出随着煎煮时间的延长，煎膏煎出率、总黄酮化合物及甘草酸在水煎液中的含量均有变化，煎煮时间由10～30 min时均呈上升趋势，40 min及其后则呈平缓下降［14］。结合前人对四君子汤提取工艺的研究，确定选择浸泡时间、加水量、煎煮时间和煎煮次数4个影响因素，并从3个水平上分别讨论这4个因素的作用。在对提取方法、纯化方法进行选择、优化的过程中，本着可行、实用的原则，以具体实验结果为基础，综合统计分析及直观分析得出结论，最终确定四君子汤最优煎煮条件为:浸泡30 min，加水量10倍、煎煮时间2 h，煎煮次数为3。

致谢:本研究由教育部高等学校博士学科点专项科研基金(No.201003060－9/10)支持，感谢CAU－BUA中兽医药学科研教学团队成员提供的无私帮助。

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