全脑缺血再灌注大鼠小脑 EGF的动态表达

赵 欣 吴 杰 李爱丽 (吉林大学第二医院神经内科，吉林 长春 130041)

表皮生长因子 (EGF)是一种神经营养因子，对中枢神经系统具有一定营养、保护作用。然而，在脑缺血再灌注损伤过程中，EGF对小脑的动态保护作用如何，目前国内、外尚无此类报道。本研究选用老龄大鼠制作全脑缺血再灌注模型，应用免疫组化技术研究全脑缺血再灌注大鼠小脑 EGF的含量变化，探讨脑缺血再灌注损伤过程中EGF对小脑的动态保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用Wistar老龄大鼠30只，雌性16只，雄性14只，体重420～520 g，月龄10个月以上。雌雄分开饲养并随机分组，假手术组5只;脑缺血15 min再灌注1 h和6 h、2 d、4 d、9 d 5 组，每组5只。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 采用改良Pulsinelli-Brierley血管阻塞法，用10%水合氯醛给大鼠进行腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)，分离双侧颈总动脉，用两根缝合线分别绕过两侧颈总动脉系一松套(待次日拉套断流用)，电凝双侧椎动脉24 h后在大鼠清醒状态下拉双侧颈总动脉套，阻断双侧颈总动脉血流15 min，此为脑缺血期，去除颈总动脉套为再灌注期。假手术组不做椎动脉电凝、颈总动脉断流，其余过程同实验组。

1.2.2 试剂与仪器 各组大鼠在完成实验过程后给予10%水合氯醛过量腹腔麻醉，暴露心脏，剪开右心耳，在左心室插管，先用200 ml生理盐水灌冲，然后用4%多聚甲醛固定脑组织，取脑分离出小脑，浸脑组织于相同固定液中48 h，石蜡包埋，免疫组化染色采用ABC法。试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。

1.2.3 测定指标 神经元、间质细胞中出现棕黄色或棕褐色颗粒判断为阳性细胞。

1.3 统计学分析 采用SPSS10.0软件，计量资料以±s组间比较采用t检验。

2 结果

在对照组，小脑分子层、梨状细胞层、颗粒细胞层和髓质均可见少量EGF免疫阳性细胞表达，棕褐色颗粒存在于细胞膜、细胞质或细胞核中。

在小脑分子层，缺血再灌注1～6 h时EGF表达与对照组没有明显差异(P＞0.05);再灌注2 d，其表达明显增加(P＜0.05)，但再灌注4～9 d时EGF表达恢复至对照组水平(P＞0.05)。在小脑梨状细胞层，缺血再灌注1～6 h时EGF表达与对照组无明显差异(P＞0.05);再灌注2 d，EGF表达呈一过性增高(P＜0.05)，此后降至正常水平。在小脑颗粒细胞层，于缺血再灌注1～6 h时EGF表达与对照组没有明显差异(P＞0.05);再灌注2～4 d，其表达持续增加。随着再灌注时间的延长，9 d时，EGF表达恢复至对照组水平(P＞0.05)。在小脑髓质，缺血再灌注1 h时EGF表达与对照组没有明显差异(P＞0.05);再灌注6 h～9 d，其表达持续减少，低于对照组水平(P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠缺血再灌注不同时间小脑EGF的表达(±s)

表1 大鼠缺血再灌注不同时间小脑EGF的表达(±s)

与假手术组比较:1)P＜0.05;不同时间点各实验组比较:2)P＜0.05

7.02±2.10 6.30±2.02 5.21±0.63 10.67±1.15再灌注1 h 5 7.05±1.36 8.32±0.81 6.02±0.62 9.36±2.01再灌注6 h 5 8.49±1.69 8.96±1.18 7.35±1.12 6.37±1.381)再灌注2 d 5 13.66±1.81)2) 10.90±1.221) 9.09±1.061) 6.55±1.521)再灌注4 d 5 9.30±1.982) 7.63±1.012) 9.98±1.581) 6.33±1.631)再灌注9 d 5 6.30±0.982) 6.80±1.35 6.66±1.192) 5.36±1.181)分子层 梨状细胞层 颗粒细胞层 髓质对照组组别 n 5

3 讨论

3.1 EGF的生物学特性及其作用机制 EGF是1962年由Cohen从雄鼠颌下腺中分离提取的一种可刺激神经生长的活性物质，主要由颌下腺腺管细胞分泌。EGF也见于生理状态下的几乎所有体液中，如唾液、血液、尿液、胃液、羊水、组织液等。尽管外周血EGF含量极少，但血小板颗粒内的EGF浓度却很高。成熟的EGF是具有53个氨基酸残基的单链多肽，分子量6 045 Da。EGF受体广泛分布于哺乳动物的上皮细胞，EGF与靶细胞表面的受体结合，通常具有高亲和性、可饱和性、特异性等特征。EGF的生物学活性可分两类:①迟发效应:促进营养细胞的DNA合成，激活鸟氨酸脱羧酶，引起腐胺的积累，提高γ-谷氨酸转肽酶的基础水平，增加角蛋白、纤维蛋白和胶原蛋白的合成，促进骨形成等。②短期效应:发生在摄入EGF的数秒钟到数分钟内，包括促进或抑制离子、分子的转运，影响磷酸盐的代谢等。EGF与其受体结合后能促进创伤愈合，已被用于角膜、胃、肠道、肝脏、骨骼、神经等多种组织创伤的研究。EGF对神经系统发育、营养均有重要作用，其作用机制尚有待于进一步研究。有学者认为可能与一种神经介质合成酶的酪氨酸羟化酶的水平变化有关。生理状态下，1 ng/ml的EGF就能显著提高中枢神经系统神经元的存活力和轴索的再生能力，当EGF达到10 ng/ml时作用达到顶点。EGF对帕金森病患者黑质纹状体多巴胺神经元具有保护作用〔1〕，对外周神经也具有神经营养作用，因为阻断EGF的信息传递途径能明显影响神经轴突的生长〔2〕。

3.2 EGF的表达及意义 本研究结果显示，小脑缺血再灌注1 h其各层结构EGF的表达均无明显增加;于缺血再灌注6 h小脑分子层、颗粒细胞层和梨状细胞层其表达也无明显增加，这表明小脑分子层、颗粒细胞层和梨状细胞层均不具有快速敏捷的EGF保护作用，这就提示临床医生在缺血性脑血管疾病早期应尽早给予神经营养剂治疗，以保护受损的脑组织。再灌注2 d，除小脑髓质外其他三层结构EGF表达均增加，说明小脑大部分组织具有迟发性EGF的保护作用。笔者以往关于海马与EGF的研究中，缺血再灌注6 h海马内EGF表达即开始增加，故小脑与海马相比前者EGF的保护作用具有滞后性。再灌注4～9 d，小脑分子层和梨状细胞层EGF表达均回降至基础水平，表明小脑分子层和梨状细胞层EGF的保护作用较为短暂。而小脑颗粒细胞层于再灌注4 d EGF表达仍在增加，再灌注9 d时EGF表达降至对照组水平，说明小脑颗粒细胞层EGF的神经元保护作用强于小脑其他各层，故小脑颗粒细胞层具有较为持久的EGF保护作用。EGF是通过一氧化氮酶抑制细胞凋亡而对小脑颗粒细胞产生保护作用〔3〕。小脑髓质于再灌注6 h～9 d期间，EGF的表达一直处在低于假手术组水平，这表明小脑髓质缺乏EGF的保护作用，提示临床小脑髓质可能更易受到缺血损害，应注意保护。

1 Hanke M，Farkas LM，Jakob M，et al.Heparin-binding epidermal growth factor like growth factor:a component in chromaffin granuleswhich promotes the survival of nigrostriatal dopaminergic neurones invitro and in vivo〔J〕.Neuroscience，2004;124(4):757-66.

2 Hermann PM，Nicol JJ，Nagle GT，et al.Epidermal growth factor-dependent enhancement of axonal regeneration in the pond snail Lymnaea stagnalis:role of phagocyte survival〔J〕.J Comp Neurol，2005;492(4):383-400.

3 戴 德，钟艳秋.表皮生长因子抑制小脑颗粒细胞凋亡的作用〔J〕.宁夏医学杂志，2006;28(5):357-9.