1株多重耐药的金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

李静怡 贾小雅 魏晓莉 方热军 李 芳 张建民 郭莉莉 陈济铛 徐成刚 ( 华南农业大学兽医学院 广州 5064 湖南农业大学动物科学技术学院 长沙 40000 3 河南省内黄县畜牧局 河南 安阳 456300〉

葡萄球菌病是由金黄色葡萄球菌或其他葡萄球菌引起的多种畜禽共患的一种急性败血性传染病，一般认为金黄色葡萄球菌是主要的致病菌。鸡金黄色葡萄球菌病是一种多发、易发的禽病,尤其现在的禽类养殖多采用集约化方式，接触、摩擦、蹬踩及消毒不彻底都易引发此病[1]。金黄色葡萄球菌引起的严重感染的发病率在全球范围内迅速增加，由于该菌对抗菌药物的交叉耐药十分严重，给临床治疗造成了极大的困难，应受到广泛的关注[2～3]。2009年4月，广东省某鸡场发生一起以胸腹部、翅内侧等处羽毛脱落，皮肤呈紫红色、破溃为主要临床特征的疾病，病鸡精神沉郁，食欲减退，灰白色或黄绿色水样下痢。该养户一批鸡苗于36日龄开始出现零星死亡，之后死亡率高达9%。采集病鸡肝脏及心血病料，经细菌分离鉴定，确诊为金黄色葡萄球菌感染。该病发病急，潜伏期短，1～3天即发病死亡。对该菌株做了20种药物的药敏试验，发现其耐药性很强。

1 材料与方法

1.1 病理变化及病料采集

发病鸡剖检可见皮下充血，胸腹部有散在出血斑；脾、肝脏肿大，有灰黄色坏死灶；心包发黄，内有混浊的渗出液；大肠后段发炎，肠腔内充满深红色血块。无菌操作采集病鸡肝脏及心血病料。

1.2 主要试剂

1.2.1 培养基及生化试剂：普通营养琼脂培养基、绵羊血和三糖铁琼脂培养基，葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇细菌生化微量鉴定管,均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2.2 药敏纸片：林可霉素、氯霉素、利福平、强力霉素、舒普深、头孢噻肟、头孢他定、万古霉素、头孢拉定、卡那霉素、阿米卡星、阿莫西林、阿奇霉素、氨苄西林、恩诺沙星、新霉素、氟哌酸、复方新诺明、环丙沙星和甲氧苄胺嘧啶，均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.3 实验动物

10日龄健康雏鸡由广东省农业科学院畜牧研究所提供。

1.4 细菌分离培养

取病料无菌操作划线接种于普通琼脂平板，置温箱37℃培养24h镜检；纯化后划线接种于鲜血琼脂平板上，37℃培养24h，观察结果。

1.5 细菌形态观察

无菌操作挑取单菌落进行涂片，革兰氏染色镜检。

1.6 生化试验

将细菌分离物纯化后增菌培养，进行生化特性试验，生化项目及试验方法按文献[4]进行。

1.7 药敏试验

用纸片琼脂扩散法，将细菌涂布到普通琼脂板，将贴药敏片的平板置37℃温箱中培养18h，取出观察结果，测量抑菌圈直径。抗菌药物药敏试验采用改良的K-B法，参考上海医学化验所介绍方法[5]。

1.8 动物回归实验

取10日龄健康鸡10只，分别给5只鸡腋下注射临床分离株24h肉汤培养物0.2mL，其余5只右翅皮下注射0.2mL灭菌肉汤作为对照。采取隔离饲养，并观察结果，发病或死亡者再作病原菌分离。

2 结果

2.1 细菌分离培养

无菌操作接种病料于普通琼脂培养基和血平板上，37℃培养24h。在普通培养基上可见灰白色圆形、湿润、表面隆起、边缘整齐、直径1～2mm的不透明光滑菌落，随培养时间的延长，逐渐变成金黄色。在鲜血琼脂平板上形成湿润、光滑、隆起、边缘整齐、直径1～2mm的菌落，菌落周围有溶血环。挑取可疑菌落镜检并进行细菌纯化。

2.2 细菌形态观察

经革兰氏染色镜检，可见到革兰氏阳性球菌，呈均匀一致、单个、成双或不规则葡萄串状排列。

2.3 细菌鉴定

生化鉴定显示，该菌株能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖，产酸不产气，在三糖铁培养基上斜面和底层均产酸，不产生H2S，不产气；血浆凝固酶试验和过氧化氢酶试验皆为阳性。生化鉴定表明该菌为金黄色葡萄球菌。

2.4 药敏试验

试验方法及结果判读均遵循美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的标准[6]进行，结果见表1。

2.5 动物回归实验

实验组攻毒后全部发病，24～36h后3只鸡死亡，死亡率为60%。发病鸡精神委顿，皮肤发绀,关节肿胀处皮下水肿，呈灰黄色或红黄色、胶冻样；部分病死鸡胸部皮肤及表层肌肉溃烂，有干酪样黄色渗出物。剖检可见脾、肝脏肿大，有灰黄色坏死灶；心肌有出血点，心包发黄，有混浊的渗出液。死雏病料接种培养后，分离到金黄色葡萄球菌。对照组雏鸡全部健康存活。

表1 金黄色葡萄球菌药敏试验结果

3 分析与讨论

本实验中，病鸡剖检病变特征为皮肤呈紫红色，有的破溃，皮下浸润出血。从病鸡病料中分离到1株细菌，根据培养特性观察、染色镜检和生化试验结果可将该菌株判定为金黄色葡萄球菌。对该菌做了20种抗菌药的药敏试验，该菌对14种抗菌药耐药，对3种抗菌药敏感，对3种抗菌药中敏。结果表明该菌耐药性极强，应引起广泛注意。

金黄色葡萄球菌属于条件致病菌，在自然环境中广泛存在，在卫生条件较差的饲养场更易发生该菌的感染。鸡葡萄球菌病表现多种临床症状，包括鸡卵黄囊感染、皮下脓肿、跛脚、败血症、关节炎、脊椎炎、坏疽性皮炎以及细菌性心内膜炎、肝的肉芽肿等，给养鸡业造成较大经济损失。葡萄球菌极易产生耐药性，随着抗菌药物的大量使用，不断出现新的耐药菌株，细菌的耐药率也不断上升。耐药葡萄球菌所致感染是临床治疗棘手问题，发病后的治疗要先做药敏实验，选择最敏感药物。

[1]史晓涛，陈立功，翟文栋，等.皮炎型鸡葡萄球菌病的诊断[J].养禽与禽病防治，2009，2：35.

[2]李月翠.5年中金黄色葡萄球菌的药敏及分离率变迁分析[J].中华医院感染学杂志，2007，17(1)：83.

[3]傅先强,刘占君.养鸡场禽病检验手册 [M].北京：中国农业大学出版社,1992,172-173.

[4]姚火春.兽医微生物学实验指导（第二版）[M].北京：中国农业出版社,2002,57～58.

[5]上海医学化验所编，抗生素药物敏感试验.1993.

[6]NCCLS.Disk Difusion Supplemental Tables.M100-S10(M2)January2007.