一年和二年生人工种植唐古特大黄蒽醌类成分的变化

周 利， 陈桂琛， 史 萍*

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237;2.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810001)

大黄属于蓼科植物，性寒味苦，是我国常用中药。大黄在传统中医药理论中具有“泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经、利胆退黄”的功效。现代药理及临床研究表明，大黄具有泻下、抗菌、抗肿瘤、抗高血脂、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、消炎、延缓机体衰老、清除体内氧自由基、调节免疫等诸多作用［1-2］。

长期以来药用大黄来源依赖野生大黄。由于盲目经营、贪婪滥挖，资源缺乏保护，致使野生资源几近枯竭，有些品种如野生唐古特大黄陷入濒危灭绝的境地［3］。为了更有效的开发利用这一资源并保护大黄种群，对野生唐古特大黄进行人工栽培研究，分别选择青海大黑沟、群加两处作为实验基地。大黑沟和群加分地处青海省湟源县东峡乡和湟中县拉脊山北坡，海拔约2 900 m，为高寒阴湿山区，年降水量300～600 mm，适合于大黄等药用植物资源的栽培。

野生唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf，其主要有效化学成分是蒽醌类衍生物，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等［4］。有文献报道人工栽培二年、三年和四年生唐古特大黄蒽醌类化学成分的研究［5］，但尚未见一年期人工栽培唐古特大黄成分的报道。本试验研究和比较一年生和二年生人工栽培唐古特大黄蒽醌类成分变化，为满足不同需求的人工种植大黄及收获季节提供重要的科学依据和理论指导。

1 实验部分

1.1 材料 对照用唐古特大黄样品购于青海果洛药材市场。实验样品分别为青海大黑沟(一年)、大黑沟(二年)和青海群加(一年)、群加(二年)人工栽培唐古特大黄，采摘期为9月份。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器 HP1100型高效液相色谱仪(Agilent，美国，仪器操作及数据处理配有3-D化学工作站)，色谱柱为 Alltima 4.6 mm ×250 mm，5 μm C18反相柱。紫外可见分光光度计(UV一265FW，日本岛津);分析天平(DF京光学仪器厂)。

1.2.2 试剂 甲醇、乙腈均为色谱纯，天津西华特种试剂厂;N，N—二甲基甲酰胺，分析纯，北京昌化精细化工厂;乙酸镁、氯仿和硫酸，分析纯，北京化工厂;高氯酸，优级纯，天津市东方化工厂;无水硫酸钠，分析纯，天津市塘沽邓中化工厂;双蒸馏水(自制)。

1.2.3 标准品 5种标准品均购自中国药品生物制品检定所，批号如下:芦荟大黄素(0795-9803);大黄酸(0757-200005);大黄素(0756-200110);大黄酚(0796-200208);大黄素甲醚(758-200006)。

1.3 测试方法

(1)液相色谱分析。流动相:甲醇:1%HClO4水溶液(85:15);流量:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;进样量:10 μL。测定 5 种蒽醌类成分含量［6-7］。(2)UV法测定总蒽醌含量［8］。

2 结果与讨论

2.1 样品的提取

2.1.1 游离蒽醌的提取 精确称取0.200 g大黄

粉样品(经植物组织破碎机破碎后过60目)加30 mL氯仿在索氏提取器中回流，直到提取液无色。回收溶媒，用3.00 mL的乙腈定容残渣微孔滤膜过滤后用于HPLC测定。

2.1.2 结合蒽醌的提取 2.1.1项游离蒽醌提取后的残渣加20%的H2SO42.5 mL于室温振荡水解5 min后加30 mL CHCl3回流1 h，取上清液。残渣用CHCl3洗至无色，合并CHCl3液加2.5 g Na2SO4，回收溶媒，用乙腈定容于5 mL量瓶，用微孔滤膜过滤后用于HPLC测定。

2.2 样品的测试

2.2.1 标准样HPLC测试和回归 标准品溶液的配置:精密称取大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素各2.203 mg;2.873 mg;2.599 mg;3.068 mg;2.431 mg，用乙腈定容至10 mL量瓶得各标准贮备液，置于冰箱备用。分别取各标准贮备液2、5、10、20、50、100、200、300、400 μL 混合，用乙腈定容至2 mL，得到9种浓度水平的系列标准溶液，用以测定标准工作曲线。标样HPLC图谱如图1所示，其浓度Y和峰面积X的计算关系结果如表1所示。

图1 5种标样蒽醌成分的HPLC图谱

2.2.2 样品的紫外吸收测试 标准曲线的绘制:精取大黄素标准品10 mg，加甲醇溶解置10 mL量瓶中至刻度，摇匀作为贮备液。精取一定量的上述大黄素标准品贮备液用1%乙酸镁甲醇溶液稀释得5、10、15、20、25 μg/mL 的梯度液摇匀，在 510 nm 处测定吸收度，以吸收度(Y)与标准品大黄素的含量(X)计算，回归方程为Y=30.625X－0.007 3，相关系数r=0.999 3。

表1 5种标准蒽醌成分HPLC分析回归结果

样品在测试前，经过如下的处理:称取大黄粉(60目)0.2 g加20%的H2SO43 mL于100℃水浴中振荡水解30 min，加30 mL CHCl3回流1 h，取上清液，残渣加30 mL CHCl3再回流0.5 h直至回流液无色，合并CHCl3液加3 g Na2SO4，回收溶媒，用1%乙酸镁甲醇液溶解定容至10 mL，同前测定吸收度，按回归方程计算含量。

2.2.3 各样品的游离蒽醌的含量 2.1.1项提取液经HPLC测定，然后根据峰面积计算个样品中大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素含量，其结果如表2所示。

表2 样品中游离蒽醌类化合物的含量(±s)

表2 样品中游离蒽醌类化合物的含量(±s)

*n.d.=检测不到

样品源 芦荟大黄素/% 大黄酸/% 大黄素/% 大黄酚/% 大黄素甲醚/% 总量/%果洛(市场)0.007 752大黑沟(一年)0.001 519±0.000 081 0.082 246±0.004 032 0.003 8±0.000 211 0.018 589±0.001 123 0.006 173±0.000 311 0.112 327±0.023 653±0.002 346大黑沟(二年)0.000 747±0.000 032 0.006 692±0.000 342 0.003 076±0.000 142 3 0.008 902±0.000 625 0.004 236±0.000 156 0.104 595±0.004 356群加(一年)0.006 535±0.000 343 0.072 078±0.005 12 0.005 375±0.000 271 0.015 24±0.001 132 0.005 367±0.000 443 0.099 83 0.006 563±0.000 712群加(二年)0.000 309±0.000 017 n.d.* 0.000 983±0.000 046 7 0.005 642±0.000 294 0.073 179±0.003 568 0.003 455±0.000 207 0.001 816±0.000 138 0.005 544±0.000 279 0.017 922±0.001 823 0.003 643±0.000 345 0.105 93±

由表2的结果可以看出，随着栽种时间由一年增加到二年，大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸和大黄素这5种化合物的含量都有所增加;二年生人工种植样品中，无论是结合或总游离蒽醌，大黑沟和群加人工种植的大黄已接近药材市场上购买的成品大黄中的含量;从一年生大黄成分分析可以看出，大黑沟人工种植大黄中蒽醌类成分明显高于群加种植的大黄，表明不同的生长土壤和地理环境种植的大黄其成分有所不同。从表2中大黄素甲醚的比较可以看出，相对于其他成分而言，其一年期和二年期种植的大黄中含量变化比较小，而且比较接近市售成品大黄中大黄素甲醚的含量。

2.2.4 各样品结合蒽醌的含量 同上测得各样品中5种结合蒽醌类化合物的含量，结果见表3。通过各样品中结合蒽醌类化合物含量的比较可以看出，人工种植大黄生长期从一年增加到二年，无论在大黑沟还是群加种植，其5种结合蒽醌大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸和大黄素都有显著增加。对于一年期大黑沟和群加地区人工种植大黄，其结合大黄酸含量已超过市售成品大黄中结合大黄酸的含量。

相对于游离蒽醌含量，二年期人工种植大黄中结合芦荟大黄素、大黄素和大黄酚与市售成品大黄差2～3倍，而二年期大黄中结合大黄素甲醚的含量仅为市售成品大黄的十分之一左右。从一年期增加到二年，大黑沟和群加地区种植的大黄中结合大黄素甲醚的增加量相对也比较少。

表3 样品中5种结合蒽醌类化合物的含量(±s)

表3 样品中5种结合蒽醌类化合物的含量(±s)

样品来源 芦荟大黄素/% 大黄酸/% 大黄素/% 大黄酚/% 大黄素甲醚/% 总量/%果洛(市场)0.034 021大黑沟(一年)0.100 34±0.007 321 0.064 304±0.003 002 0.062 87±0.003 358 0.299 284±0.019 692 0.053 488±0.002 675 0.580 286±0.237 648±0.022 785大黑沟(二年)0.015 893±0.000 823 0.174 184±0.006 754 0.013 261±0.000 663 0.026 183±0.001 563 0.008 127±0.000 443 0.606 596±0.025 741群加(一年)0.039 503±0.002 177 0.511 092±0.028 537 0.013 437±0.000 712 0.035 856±0.001 927 0.006 708±0.000 532 0.118 795±0.005 582群加(二年)0.008 71±0.000 921 0.087 199±0.003 847 0.004 721±0.000 492 0.052 239±0.001 985 0.577 239±0.038 421 0.013 571±0.000 774 1 0.004 594±0.000 279 0.025 378±0.002 134 0.050 378±0.003 916 0.006 898±0.000 578 0.712 132±0.039 602

2.2.5 总蒽醌含量的测定 在用高效液相色谱对5种蒽醌类化合物进行测定的同时，也采用紫外分光光度法对不同样品中总蒽醌的含量进行测定，结果见表4。由表4的结果和比较可以看出，人工栽培一年生大黄中总蒽醌的含量比市场购买的成品大黄有非常明显的差异，大黑沟一年生不足对照样品的三分之一，群加的不足四分之一，人工栽培两年生大黄总蒽醌的含量虽然比市场购买的成品大黄略低，但差距不大，尤其群加两年生大黄总蒽醌的含量已达到成品的95%左右。

表4 样品中总蒽醌的含量(±s)

表4 样品中总蒽醌的含量(±s)

样品来源果洛(市场) 大黑沟(一年) 大黑沟(二年) 群加(一年) 群加(二年)总蒽醌含量/% 1.257 932±0.099 782 0.379 064±0.019 705 0.983 234±0.013 244 0.261 839±0.012 183 1.196 011±0.063 215

3 结论

本试验采用分步提取和处理、高效液相色谱分析和紫外分光光度法测试手段，通过比较青海省大黑沟和群加人工种植一年期和二年期大黄与果洛市售成品大黄中5种蒽醌类成分，可以得到如下的结论:

人工种植大黄栽培期从一年增加到二年间，大黑沟和群加人工种植的大黄中结合型和游离蒽醌成分大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸和大黄素以及总蒽醌含量都有所增加;二年期人工种植大黄中其游离蒽醌含量比较接近市售成品大黄的含量，而结合型蒽醌含量与市售成品大黄中含量相比差异比较大;一年期人工种植的大黄，大黑沟人工种植的大黄中结合型蒽醌仅为市售成品大黄的三分之一左右，游离大黄素甲醚的含量比较接近市售成品大黄;群加人工种植的大黄中结合型蒽醌含量仅为市售成品大黄的四分之一左右;一年生长期人工种植大黄，无论是在大黑沟或群加种植，其结合型大黄酸含量均高于市售成品中结合型大黄酸的含量。

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