基于调脂抗氧化有效部位的降脂宁HPLC指纹图谱研究

罗 文， 刘 斌，2*， 王 伟， 石任兵，2

(1.北京中医药大学，北京 100102;2.国家中医药管理局中药经典名方有效物质发现重点研究室，北京 100102)

降脂宁由山楂、制首乌、决明子、荷叶四味中药 组成，载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药)第十三册［1］，具有降血脂、软化血管作用［2］，临床用于预防和治疗高脂血症。我们采用大孔树脂吸附技术，结合药理学研究，筛选确定了降脂宁调脂抗氧化有效部位［3－6］。本实验建立了基于调脂抗氧化有效部位的降脂宁HPLC指纹图谱，并通过复方与组方各药材 HPLC 指纹图谱［7－9］的相关性研究，对降脂宁HPLC指纹图谱色谱峰进行了归属。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，包括1525型二元高压梯度泵，2487型二级管阵列检测器和1500型柱温箱(美国 Waters公司);Sartorious BT 25S型 1/100000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);KQ－500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1～9批组方药材山楂、制首乌、决明子、荷叶购自全国各地，经北京中医药大学张贵君教授鉴定分别为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifidaBge.var.major N.E.Br.的干燥成熟果实、蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根、豆科植物决明子Cassia obtusifoliaL.的干燥成熟种子和睡莲科植物莲Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥叶;第10批组方药材山楂、制首乌、决明子、荷叶均为对照药材，购自中国药品生物制品检定所。2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品(批号:08440－200402)购自中国药品生物制品检定所。

乙腈(Sigma－aldrich公司，色谱纯);屈臣氏重蒸水;其他试剂为分析纯，购自北京北化精细化学品有限责任公司。

2 样品溶液制备

2.1 降脂宁调脂抗氧化有效部位制备 参照文献［3］方法，制备降脂宁调脂抗氧化有效部位。

2.2 参照物溶液 精密称取2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品3.66 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密移取1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为参照物溶液。

2.3 供试品溶液 取降脂宁调脂抗氧化有效部位约25 mg，精密称定，置锥形瓶中，加50%乙醇10 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3 色谱条件

色谱柱:Agilent TC－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相:0.01%甲酸水溶液(A)－乙腈(B)(0～40 min，97:3～86:14;40 ～65 min，86:14 ～84:16;65～100 min，84:16～70:30;100～110 min，70:30 ～50:50;110～120 min，50:50～0:100)。流速:1.0 mL/min，检测波长:280 nm;柱温:30℃。

4 方法学考察

4.1 精密度试验 精密吸取2.3项下供试品溶液10 μL，连续进样 5 次，测定 HPLC 图谱。以 2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰 16)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD值＜2%，相对峰面积RSD值＜3%。表明方法精密度良好。

4.2 稳定性试验 精密吸取2.3项下供试品溶液，分别于制备后 3、6、9、12、15、18、24 h 进样，测定HPLC 图谱。以 2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰16)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD值＜2%，相对峰面积RSD值＜3%。表明供试品溶液在24h稳定。

4.3 重复性试验 取同批次药材5份，制备5批降脂宁调脂抗氧化有效部位。分别取5批有效部位各约25 mg，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样，测定 HPLC 图谱。以 2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰16)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD值＜2%，相对峰面积RSD值＜3%。表明方法重复性良好。

5 指纹图谱建立

5.1 指纹图谱及技术参数 取同批次药材和不同批次药材，分别制备10批降脂宁调脂抗氧化有效部位。按2.3项下方法制备供试品溶液，进样，测定HPLC图谱。采用国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统，进行时间窗设定、谱峰匹配，确定降脂宁指纹图谱29个共有色谱峰，见图1、2。选择2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰16)作为参照峰，计算各共有指纹峰相对保留时间 和相对峰面积，结果见表1～4。

图1 降脂宁调脂抗氧化有效部位HPLC指纹图谱色谱峰S.2，3，5，4’－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷Fig.1 The chromatographic peaks in the fingerprint of the lipid-regulation and anti-oxidation effective fraction of Jiangzhining granulesS.2，3，5，4’－Tetrahydroxystilbene－2－O－β－D－glucoside

图2 降脂宁调脂抗氧化有效部位HPLC指纹图谱R.对照图谱S1～10.10批降脂宁调脂抗氧化有效部位A.同批次药材 B.不同批次药材Fig.2 The fingerprint of the lipid-regulation and anti-oxidation effective fraction of Jiangzhining granulesR.The reference fingerprint S1 ～ 10.10 batches of the lipid－regulation and anti－oxidation effective fraction of Jiangzhining granules A.The same batches of herbs B.The different batches of herbs

表1 共有峰相对保留时间(同批次药材)Tab.1 The relative retention time of common peaks and their RSDs(the same batches of herbs)

表2 共有峰相对峰面积(同批次药材)Tab.2 The relative retention areas of common peaks and their RSDs(the same batches of herbs)

表3 共有峰相对保留时间(不同批次药材)Tab.3 The relative retention time of common peaks and their RSDs(the different batches of herbs)

表4 共有峰相对峰面积(不同批次药材)Tab.4 The relative retention areas of common peaks and their RSDs(the different batches of herbs)

5.2 指纹图谱相似度计算 应用国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价系统计算软件，计算各样品指纹图谱与共有模式对照图谱R之间的相似度。结果同批次药材制备有效部位相似度在0.994～0.998，不同批次药材制备有效部位相似度在0.913～0.975之间。

6 指纹图谱与组方药材的相关性分析

采用2.1项和2.3项下方法，分别制备组方药材制首乌、山楂、荷叶、决明子供试液，及分别缺制首乌、山楂、荷叶、决明子的阴性样品溶液。按3项下色谱条件进样分析，获得各组方药材及阴性样品HPLC色谱图。以色谱峰相对保留时间相对偏差为指标，对降脂宁指纹图谱共有峰与组方药材的相关性进行分析。结果峰1～4、8和9归属于山楂，峰5、6、11 ～13、15 和 17 ～19 归属于荷叶，峰 7、10、14和16归属于制首乌，峰20～29归属于决明子。

7 讨论

7.1 色谱条件选择 色谱柱分别试用了Agilent TC－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Waters Symmetry Shield RP18柱(4.6 mm ×150 mm，5μm)、SunFire C18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)、Nova－Pak C18柱(3.9 mm × 150 mm，5 μm)和 Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，以 Agilent TC－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)分离度好，色谱峰对称性好，基线平稳。分别选取238、254、280、320 nm作为检测波长，以色谱峰数目及其积分面积为指标，确定检测波长为280 nm。分别用水－乙腈、水－甲醇、0.1%甲酸水溶液－乙腈、0.01%甲酸水溶液－乙腈混合溶剂为流动相，以不同洗脱梯度进行试验，确定了流动相及其洗脱梯度。

7.2 供试品溶液制备方法考察 取降脂宁调脂抗氧化有效部位4份，每份约25 mg，精密称定，置锥形瓶中，分别加入水、甲醇、50%甲醇和50%乙醇各10 mL，称重，超声提取30 min，放冷，称重，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，得到不同溶剂提取的可检出成分谱。经过分析可知50%乙醇提取获得的成分数量较多且含量高，故选择50%乙醇作为溶剂。另取降脂宁调脂抗氧化有效部位3份，每份约25 mg，精密称定，置锥形瓶中，分别用50%乙醇10 mL以超声30 min、回流30 min、浸泡24 h方式进行提取，放冷，称重，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，得到不同提取方式的可检出成分谱。经过分析可知超声提取获得的成分数量较多且含量高，故选择超声提取方式。

7.3 指纹图谱评价 分别比较由同批次药材和不同批次药材制备的10批降脂宁调脂抗氧化有效部位指纹图谱，发现其指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，虽然不同产地样品中各成分含量的相对比值有一定差别，但10批样品指纹图谱相似度分别均在0.99和0.90以上。表明降脂宁调脂抗氧化有效部位制备工艺稳定、重现性良好，建立基于调脂抗氧化有效部位的降脂宁HPLC指纹图谱是可行的，不仅能够从整体上全面而有效地控制降脂宁的质量［10］，而且能够实现中药复方指纹图谱与其功效的有效链接，实现指纹图谱化学物质属性与生物活性表征的有机结合，使指纹图谱的质量控制方法更有针对性。

7.4 复方指纹图谱与组方药材的相关性分析 以降脂宁为研究对象，在建立复方HPLC指纹图谱基础上，通过对各组方药材及其阴性样品HPLC图谱的检测，以色谱峰相对保留时间相对偏差为考察指标，对降脂宁指纹图谱中的29个共有色谱峰进行归属。其中峰1～4，8，9来自山楂;峰20～29来自决明子;峰5，6，11 ～13，15，17 ～19 来自荷叶;峰7，10，14，16来自制首乌。该指纹图谱相关性分析方法可较为准确地判别降脂宁指纹图谱中主要色谱峰的归属，有助于快速确定降脂宁的化学成分组成;同时，若结合降脂宁药理学指标分析，又可借此建立降脂宁与组方药材药效间的联系，分析各药材在降脂宁整体药效中的作用，对降脂宁的组方原理和配伍理论研究也具有积极意义。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂(第十三册)［S］.1997:116.

［2］关建红，薛 征，任晋斌.降脂宁调脂及抗动脉粥样硬化的研究［J］.中药药理与临床，2001，17(4):29.

［3］杨 英，刘 斌，毕力夫，等.降脂宁有效部位及其药效组分对脐静脉内皮细胞损伤的保护作用［J］.北京中医药大学学报，2009，32(3):160－163.

［4］杨 英，刘 斌，毕力夫，等.降脂宁调血脂及抗脂质过氧化作用的实验研究［J］.中华中医药杂志，2009，24(5):647－649.

［5］杨 英，刘 斌，王 伟，等.降脂宁有效部位及其药效组分对胆固醇代谢的影响［J］.北京中医药大学学报，2009，32(9):603－607.

［6］徐冬艳，刘 斌，王 伟.基于抗氧化效应的降脂宁质量评价方法研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(10):44－47.

［7］罗 文，刘 斌，王 伟，等.何首乌药材HPLC指纹图谱研究［J］.北京中医药大学学报，2008，31(8):557－560.

［8］罗 文，刘 斌，王 伟，等.山楂药材 HPLC指纹图谱研究［J］.现代药物与临床，2009，24(1):39－42.

［9］罗 文，刘 斌，王 伟，等.决明子药材HPLC指纹图谱研究［J］.北京中医药大学学报，2009，32(2):115－117.

［10］罗 文，刘 斌，王 伟，等.基于降脂宁调脂抗氧化有效部位HPLC指纹图谱的多指标成分定量方法研究［J］.北京中医药大学学报，2010，33(6):413－416.