壮药土垅大白蚁菌圃多糖的分析研究

苏 青， 黄瑞松， 刘 婧

(广西壮族自治区民族医药研究院，广西南宁 530001)

土垅大白蚁菌圃系昆虫纲动物土垅大白蚁Macrotermes annandalei(Silvestri)的干燥菌圃。又称白蚁巢，为常用壮药材，壮语名称Rongzmoedhau(容门豪)，具通调气道，补肺温肾，止咳平喘等功效［1］。其含氨基酸，酚性等化学成分［2-3］。现代药学实验证明:本品水提物具有镇咳、平喘、祛痰、抗炎、镇痛、提高免疫力功能及抗衰老等生物活性［4-9］。以本品为主药的处方已成功被研制成民族药制剂“固本止咳膏”［10］。近年研究又证实了本品多糖具有提高机体免疫功能的活性作用［11］。为进一步阐明本品多糖的化学构效及其内在物质基础，本实验对其所含多糖进行定性定量分析研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2401PC可见紫外分光光度计(日本岛津公司)，YOKO-ZS紫外分析摄影仪(武汉药科新技术开发有限公司)，1/105电子分析天平XS205BDU(瑞士梅特勒公司)、As7240BT超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);YOKO-XR显色加热器(武汉药科新技术开发有限公司)等。

1.2 试药试剂 高效硅胶G板(青岛海洋化工有限公司)、D-葡萄糖(中国医药集团上海化学试剂有限公司)、D-半乳糖(国药集团化学试剂有限公司)、D-木糖(中国惠兴生化试剂有限公司);试验所用试剂均为分析纯;实验室用水为蒸馏水。

1.3 材料 土垅大白蚁菌圃:共采集13个不同产地的样品，其中南宁市郊4的样品分别为同一窝蚁巢在不同时间采集了6份样品。其蚂蚁兵蚁经广西大学动物科技学院潘红平副教授鉴定，为土垅大白蚁Macrotermes annandalei(Silvestri)，各批样品采集地点和时间详见表1、2;土垅大白蚁菌圃多糖:自制，制法详见“2.1土垅大白蚁菌圃多糖样品的制备”项下。

表1 不同产地土垅大白蚁菌圃多糖含量测定结果

表2 不同采集时间土垅大白蚁菌圃多糖含量测定结果

2 方法与结果

2.1 土垅大白蚁菌圃多糖样品的制备 称取1号土垅大白蚁菌圃粗粉(过10目筛)50 g，加水浸泡1 h后，煎煮提取6次(煮至 α-萘酚试验呈阴性反应)，每次1 h，每次加水约500 mL，纱布滤过，合并滤液，滤液浓缩至约100 mL后，离心，取上清液以Sevag法去蛋白。浓缩去蛋白的多糖溶液至50 mL，放冷，加入乙醇使溶液乙醇终浓度为80%，冰箱中静置过夜，离心，取醇沉物，依次以无水乙醇、丙酮洗涤后，于50～60℃干燥，得浅灰色的土垅大白蚁菌圃多糖粉末。依照此法制得上述18个土垅大白蚁菌圃多糖样品，各批样品多糖得率在13.0% ～22.0% 之间，详见表1、2。

2.2 土垅大白蚁菌圃多糖TLC分析

2.2.1 方法 称取上述18个多糖样品各约20 mg，分别加6 mol/L的盐酸11 mL，置沸水浴中回流1 h，取出，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL溶解，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取于105℃干燥至恒重的D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖对照品适量，加水制成每1 mL各含0.1 mg的混合糖溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述12个不同产地和6个不同时间采集(同一窝蚁巢)的供试品溶液各 1 ～2 μL、对照品溶液2 μL，分别点于2 块高效硅胶G薄层板上(不同产地，不同采集时间各1块)，以正丁醇-丙酮-水(21∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以苯胺-邻苯二甲酸试液，于150℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯光(365 nm)下检视。供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，详见图1。

图1 土垅大白蚁菌圃多糖色谱图

2.3 土垅大白蚁菌圃多糖含量测定

2.3.1 标准曲线的制备 精密称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，加水制成0.1 mg/mL的对照品溶液，摇匀，备用。分别精密吸取该对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，供测试用。再精密吸取上述稀释后的对照品溶液各1.0 mL，加5%苯酚试液1.0 mL，摇匀，迅速加浓硫酸5.0 mL，摇匀，室温下超声15 min，取出。以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录ⅤA)，于490 nm波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果葡萄糖对照品在5.0～30.0 μg/mL之间其吸光度和浓度呈良好线性关系，其回归方程为:y=0.020 41х+0.000，R2=0.998 5。

2.3.2 换算因子测定 准确称取精制多糖(1号)10 mg，加水使之溶解，制成0.01 mg/mL的供试品溶液，摇匀，备用。再精密吸取该溶液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按“2.3.1标准曲线的制备项下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，，根据标准曲线求出糖含量，然后按下式计算换算因子 f，f=w/(C·D)，w:多糖重(mg)，C:葡萄糖浓度(μg/mL)，D:稀释因素，得 f=1.08，RSD=1.70%。

2.3.3 精密度试验 精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，备用。再精密该稀释溶液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按“2.3.1标准曲线的制备项下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，连续测定5次，结果RSD为0.145%，表明仪器的精密度高。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液(1号)1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，备用。再精密吸取该稀释溶液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，按“2.3.1标准曲线的制备项下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，分别于 0、30、60、90、120、180 min 各测定一次吸收度，结果RSD为0.420%，表明本法显色后在3 h内吸光度稳定。

2.3.5 重复性试验 取1号样品粉末约0.1 g(n=5)，精密称定，加水使之溶解，制成0.1 mg/mL的供试品溶液，摇匀，备用。精密吸取该溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，供测试用。再精密吸取该稀释溶液1.0 mL，置10 mL具塞刻度试管中，按“2.3.1标准曲线的制备项下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，计算得样品多糖平均含量为14.34%，RSD为0.120%，表明本法重现好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量1号的多糖样品(多糖含量为14.34%)粉末约0.1 g，精密称定5份，加水制成0.1 mg/mL的溶液，摇匀，备用。精密吸取该溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，分别准确加入0.1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加水定容至 10 mL，摇匀，供测试用。再精密吸取上述稀释溶液各1.0 mL，置10 mL具塞试管中，按“2.3.1标准曲线的制备项下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，依法进行测定。计算其平均回收率为99.98%，RSD为0.738%详见表3。

表3 加样回收率试验结果

2.3.7 土垅大白蚁菌圃多糖测定 取上述18个土垅大白蚁菌圃多糖样品粉末0.1 g(n=3)，精密称定，加水使之溶解，制成0.1 mg/mL的溶液，摇匀，备用。分别精密吸取该溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，供测试用。再精密吸取上述稀释溶液各1.0 mL，置10 mL刻度试管中，按“2.3.1标准曲线的制备项下”自“加入5%苯酚溶液1.0 mL……”起，同法操作，依法测定。根据回归方程，按下列计算公式，求得不同产地、不同采集时间土垅大白蚁菌圃粗多糖中多糖含量(以葡萄糖计)在14.34% ～23.91%之间，结果详见表1、2。

多糖含量%=CDf/W×100

式中C:供试品溶液的浓度(μg/mL);D:供试品溶液的稀释因素;f:换算因子;W:供试品重量(μg)。

3 讨论

3.1 TLC鉴别中，我们对该药材13个不同产地和6个(同一窝蚁巢)不同时间采集的多糖样品的水解产物进行了单糖组分的鉴别。试验结果表明，各批样品多糖的酸水解产物TLC图谱相似，即在紫外光365 nm波长处均可检识到3个明显的黄色荧光斑点，并与对照品 D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖相对应。提示本品多糖酸水解产物均含D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖等单糖组分。

3.2 在TLC法的供试液制备中，本试验进行了多糖酸水解条件的探讨。我们比较了在100℃下，以1 mol/L、2 mol/L硫酸水解7 h，6 mol/L盐酸水解1 h 3种水解方式，结果除2 mol/L硫酸外，1 mol/L硫酸及6 mol/L盐酸的酸水解产物均可检视到单糖的斑点，且表现斑点均一致。故从操作简易出发，本试验采用6 mol/L盐酸进行酸水解。

3.3 采用苯酚-硫酸比色法对该药材12个不同产地和6个(同一窝蚁巢)不同时间采集的多糖样品进行了含量测定。试验结果表明，13个不同产地的多糖总含量在14.34% ～23.91%之间，其中广西靖西县的白蚁菌圃总多糖含量较高，为23.91%，广西南宁市郊1的白蚁菌圃总多糖含量较低，为14.34%，各产地样品多糖含量有一定差异;6个不同时间采集样品的多糖总含量19.01%～21.70%之间，含量差异不大。提示本品多糖含量随采集地不同而有差异，采集时间对其影响较小。

3.4 苯酚-硫酸比色法为测定多糖的经典方法之一，其显色的硫酸量、时间、温度、苯酚浓度等因素均对测定结果有较大影响［12］。经对上述各因素正交试验考察，我们确定了最佳的显色条件为:1.0 mL供试液中，加入5%苯酚试液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，室温下超声15 min。溶液显色后3 h内稳定。

3.5 在含量测定中，我们还进行了最大吸收峰的考察:分别取多糖供试品溶液和葡糖对照品溶液，在360～800 nm范围内进行全波段扫描。2种溶液的最大吸收峰均在(490±2)nm;故以490 nm为测定波长。

致谢:广西中医学院药学系药剂专业的实习生冯晓燕，杨云鸿，覃晓三位同学参与了本试验研究工作。

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