四物汤的HPLC指纹图谱研究

黄月纯， 魏 刚， 刘翠玲， 张琼丹

(1.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405;2.广州中医药大学，广东广州 510405)

1 仪器与试药

HP1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);二极管阵列检测器(美国安捷伦公司);阿魏酸(批号 0773-9708)、5-羟 甲 基 糠 醛 (批 号 111626-200804)、没食子酸(批号10831-200302)、芍药苷(批号 110736-200933)、苯甲酸(批号 100419-200301)与儿茶素对照品(批号110877-200001)，由中国药品生物制品检定所提供;熟地黄、白芍、当归与川芎饮片，分别购于广东多家药材公司，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定，熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosaBgeLibisch.的干燥块根的炮制加工品，白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎，以上四种饮片均符合中国药典2005版一部项下的质量要求，10批饮片按四物汤处方量配成10批;乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 Zorbax SB-Aq(250 mm ×4.6mm，5μm)色谱柱;流动相为乙腈－0.05%磷酸溶液(梯度洗脱:0～20 min，乙腈为5%→10%;20～30 min，乙腈为10%→13%;30～40 min，乙腈为13%→20%;40～45 min，乙腈为20%;45～65 min，乙腈为20%→50%;65～70 min，乙腈为50%→55%);流速为1 mL/min，柱温为35℃;白芍特征峰采用230 nm检测波长，熟地黄、当归与川芎采用290 nm检测波长为宜。

2.2 对照品溶液的制备

取没食子酸、儿茶素、苯甲酸、芍药苷对照品适量，用60%甲醇溶解配制成浓度分别为0.1 mg/mL的混合对照品溶液;取5-羟甲基糠醛、阿魏酸对照品适量，用60%甲醇溶解配制成浓度分别为0.1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

按四物汤的处方配比(熟地黄、白芍、当归与川芎为12∶12∶10∶8)，取2.5日剂量的饮片，加水800 mL，浸泡30 min，加热煮沸后文火慢煎40 min，取出，趁热滤过，药渣再加水500 mL加热煮沸后文火慢煎30 min，取出，趁热滤过，合并两次煎液，放冷，置500 mL量瓶中，加水至刻度，得全方煎剂。精密吸取四物汤煎液4 mL，精密加入甲醇6 mL，放置2 h，超声处理20 min，取出，放冷，离心，取上清液置10 mL量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。取相同处方量的单味药及缺味药，同法制成单味煎剂及缺味煎剂供试品溶液。

2.4 230 nm检测波长的分析

2.4.1 精密度试验 分别精密吸取同一四物汤供试品溶液各10μL，连续进样5次，结果10个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3.0%。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一四物汤供试品溶液各10 μL，分别在 0、2.5、5、10、24 h 进样 5 次。结果10个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好。

2.4.3 重复性试验 分别取同一批饮片5份，按供试品溶液的制备方法操作，各取供试品溶液10 μL，依法进样分析，结果10个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于5.0%。

如果“中国没有向美国明确提出南海是中国的核心利益”观点成立，则“中国能不能捍卫在南海的核心利益？”无需回答(尽管研究结论是明确可信的)，也就不会存在“南海核心利益说”所引起的南海紧张气氛。但实际情况却是，尽管“中国没有向美国明确提出南海是中国的核心利益”观点成立，“南海核心利益说”还是不胫而走，深刻影响南海局势走向。必须明确的是：“南海核心利益说”的始作俑者和推动者是美国媒体、战略界以及政界，其根本目的显然是为美国的南海利益服务。

2.4.4 样品的测定 精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按拟定方法进样分析。

2.4.5 白芍指纹图谱的建立与分析

2.4.5.1 共有峰的确定 分析10批四物汤样品，检出33～38个特征峰，经白芍单味煎剂及缺白芍煎剂对照，确定了10个共有峰，均为白芍的特征成分，见图1。各样品的出峰总数及其共有峰所占比例、共有峰面积及其所占比例见表1。

图1 四物汤HPLC图谱(230 nm)(A.四物汤 B.白芍煎剂 C.缺白芍煎剂)Fig.1 HPLC chromatograms of Siwu Decoction(230 nm)

表1 样品出峰数及峰面积分析结果(230 nm)Tab.1 Results of peak numbers and areas of Siwu Decoction(230 nm)

2.4.5.2 共有峰的鉴别 通过对照品对照及参考文献［7］共鉴别了7个特征峰，峰1、峰3、峰 4、峰 6、峰7、峰8、峰9分别为没食子酸、芍药苷亚硫酸酯、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷。

2.4.5.3 共有峰的分析 以芍药苷峰为参照峰进行计算，各共有峰的分析结果见表2。

表2 四物汤HPLC指纹图谱分析结果(230 nm)Tab.2 Results of HPLC fingerprint of Siwu Decoction(230 nm)Results

2.4.5.4 相似度分析 以国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)，计算相似度，结果在0.914～0.991之间。共有模式1见图2。

图2 10批四物汤生成的指纹图谱共有模式1(230 nm)Fig.2 Common Pattern 1 of HPLC fingerprint of Siwu Decotion(230nm)

2.5 290 nm检测波长的分析

2.5.1 精密度试验 分别精密吸取同一四物汤供试品溶液各10 μL，按拟定方法连续进样5次，结果17个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3.0%。

2.5.2 稳定性试验 精密吸取同一四物汤供试品溶液各10 μL，分别在 0、2.5、5、10、24 h 进样 5 次。结果17个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好。

2.5.3 重复性试验 分别取同一批饮片5份，按供试品溶液的制备方法操作，各取供试品溶液10 μL，依法进样分析，结果17个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于5.0%。

2.5.4 样品的测定 精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按拟定方法进样分析。

2.5.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.5.1 共有峰的确定 分析10批四物汤样品，检出34～38个特征峰，经单味煎剂及缺味煎剂对照，确定了17个共有峰，其中6个峰归属熟地黄，其余归属当归与川芎的相同类成分，见图3。各样品的出峰总数及其共有峰所占比例、共有峰面积及其所占比例见表3。

图3 四物汤HPLC图谱(290 nm)Fig.3 HPLC Chromatograms of Siwu Decoction(290nm)

表3 样品出峰数及峰面积分析结果(290 nm)Tab.3 Results of peak numbers and areas of Siwu Decoction(290 nm)

2.5.5.2 共有峰的鉴定 以对照品对照，鉴定了2个共有峰，其中峰4为5-羟甲基糠醛、峰11为阿魏酸。

2.5.5.3 共有峰的分析 以阿魏酸峰为参照峰进行计算，各共有峰的分析结果见表4。

表4 四物汤HPLC指纹图谱分析结果(290 nm)Tab.4 Results of HPLC fingerprint of Siwu Decoction(290 nm)

2.5.5.4 相似度分析 以国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)，计算相似度，结果在0.942～0.999之间。共有模式2见图4。

图4 10批四物汤生成的指纹图谱共有模式2(290 nm)Fig.4 Common pattern 2 of HPLC fingerprint of Siwu Decoction(290 nm)

3 讨论

本研究筛选了色谱柱的型号、流动相系统及梯度，采用两种检测波长可对方中四味药的特征峰均进行分析。

白芍的特征成分的含量较高，取汤剂加一定量的甲醇处理制备供试液，即可获得较理想的分离效果。汤剂中的当归与川芎特征成分的含量相对较低，曾试验采用有机溶媒萃取富集的方法制备供试液，但由于萃取对不同极性成分萃取效果的差异与浓缩过程部分成分损失，易造成特征峰相对比例的变化，不能体现汤剂中主要成分含量的相对比例，因此，分析熟地黄、当归与川芎的特征成分，采用与分析白芍特征成分的相同供试液。

230 nm波长能检测四物汤中白芍的10个特征峰，与白芍饮片特征峰基本一致［7］。290 nm波长检测的17个特征峰中，峰1～5，峰7归属熟地黄，峰4为熟地黄与川芎所共有，峰1、峰3、峰4的紫外光谱基本一致，可能同属一类成分;峰6归属当归，峰8归属川芎，峰4部分归属川芎，峰9～17均归属当归与川芎，成分鉴别还有待于进一步研究。

通过10批四物汤的分析，不同批次汤剂均具有所标示的共有峰，说明建立四物汤指纹图谱的可行性。230 nm检测波长下10样品的相似度在0.914～0.991之间，290 nm检测波长下10样品的相似度在0.942～0.999之间。本研究为四物汤物质基础探讨提供了一定参考，同时亦为含熟地黄、白芍、当归、川芎的复方煎剂指纹图谱研究提供一定参考。

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［3］黄月纯，刘翠玲，张琼丹，等.四物汤煎剂中四种成分的含量测定研究［J］.现代中药研究与实践，2010，24(4):64-67.

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［6］雷 鹏，流 韶，李新中，等.四物汤传统饮片汤剂、现代颗粒汤剂的特征色谱比较［J］.中国医院药学杂志，2003，23(12):743-744.

［7］黄月纯，魏 刚，刘翠玲，等.白芍HPLC特征指纹图谱的稳定性考察［J］.中药新药与临床药理，2010，21(3):280-284.

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