天芪降糖胶囊对糖耐量受损患者嘌呤嘧啶代谢的干预作用

钟宏福， 梁琼麟， 胡 坪， 夏建飞， 仝小林， 王义明， 罗国安*

(1.华东理工大学药学院，上海 200237;2.清华大学中药现代化研究中心，北京 100084;3.华东理工大学化学与分子工程学院，上海200237;4.中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

糖尿病前期是进展性部分代谢综合症的一种，主要是由糖代谢异常导致空腹或者糖耐量血糖过高，但未达到糖尿病诊断标准，分为空腹血糖受损(IFG)和糖耐量受损(IGT)，两者均是发展成糖尿病和心血管类疾病的危险性因素。IGT作为正常糖耐量和糖尿病之间的一种中间状态，在临床上可通过糖耐量测试来鉴定。根据世界卫生组织1999年的标准，空腹血糖 ＜7.0 mmol/L且口服75 g葡萄糖2 h后血糖≥7.8 mmol/L＜11.0 mmol/L被认为是糖耐量受损。据最新调查结果显示，目前我国糖尿病前期的发病率为15.5%(男性占16.1%，女性占14.9%)，而其中 IGT发病率约为 IFG的3.5倍［1］。因此，对糖尿病前期IGT的治疗和研究越来越受到重视。

对糖尿病前期IGT的干预主要包括生活方式和药物干预，研究证实两者均能取得良好的效果［2］。然而，对部分由于个人因素导致不适合生活方式干预或效果不明显患者药物治疗则显得尤为重要。天芪降糖胶囊是在中医理论指导下，经过长期的临床实验研究与对比得到的有效经验方，主要由黄芪、天花粉、女贞子、石斛、生晒参、地骨皮、墨旱莲、五倍子、山茱萸、黄连等中药配伍而成。在临床上主要用于糖尿病前期IGT和糖尿病各个阶段的治疗作用。

研究表明，糖尿病前期IGT患者血糖、胰岛素抵抗、尿酸水平之间存在显著的相关性(P＜0.001)［3－4］。尿酸是嘌呤代谢的终产物而嘌呤嘧啶是组成DNA和RNA的基本成分。因此，嘌呤嘧啶代谢循环可能与糖尿病的发生发展存在着一定的相关性。在本实验室前期对糖尿病及糖尿病肾病的研究中，我们发现了5种与糖尿病及其发展相关的嘌呤嘧啶类潜在生物标志物(尿酸、肌酐、黄嘌呤、肌苷、腺苷)［5－7］。本研究以嘌呤嘧啶代谢循环为基础，以血糖和尿酸、肌酐、肌苷、肌酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、胸苷、尿苷、腺苷等9种代谢物(含上述5种潜在生物标志物)浓度的变化作为研究对象来考察天芪降糖胶囊对IGT患者嘌呤嘧啶代谢循环的干预作用。

1 实验材料

1.1 样本与试剂

IGT血清(61例，年龄:(53±7)岁，收集于湖北宜昌地区，分安慰剂组和给药组);正常人血清(19例，年龄:(52±8)岁，北京中日友好医院提供);天芪降糖胶囊(黑龙江宝泉制药有限公司提供);安慰剂胶囊(不含药材，黑龙江宝泉制药有限公司制备);标准品尿酸、肌苷、肌酸、肌酐、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺苷、胸苷、尿苷均购于sigma公司;色谱纯甲醇(Fisher);超纯水(18.2 MΩ)由Millipore系统制备;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Agilent 1100液相色谱仪(二元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器);ABI公司API 3000(加拿大)三级四极杆串联质谱仪;超速离心机(Labwayscience，德国);氮气吹干仪(Organomation，美国);色谱柱:Agilent TC–C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

2 实验方法

2.1 药物干预模型建立

将61例IGT患者随机分为安慰剂组(32人，年龄:(53 ±7)岁，男/女:17/15人)和给药组(29人，年龄:(52±8)岁，男/女:13/16人)。两组在饮食和运动基础疗法相同的基础上，安慰剂组给予安慰剂胶囊，给药组给予天芪降糖胶囊，正常对照组(19人，年龄:(52 ±8)岁，男/女:9/10人)不给药。血清及临床生化信息分别于给药前、给药3个月、给药6个月收集或测量一次，临床信息主要指标包括:空腹血糖、餐后2 h 血糖、TG、TC、HDL、LDL、血尿素氮(BUN)等。

2.2 血清样本处理

在收集完整前，所有的血清样本取样后置于－80℃冰箱冻存。样本处理在室温下进行，取200 μL血清于离心管中，加800 μL甲醇，涡旋3 min，离心15 min(10 000 r/min)，上清液转移至另一离心管中，常温下N2吹干，再用100 μL氨水(0.002 mol/L)复溶，离心(12 000 r/min)15 min，取上清液注入HPLC–DAD–MS/MS分析。

2.3 色谱及质谱条件

色谱条件:Agilent TC–C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相 A:水(含 8 mmol/L 乙酸铵，用冰醋酸调pH=6.1)，流动相B:甲醇;流速:0.8 mL/min;检测波长:275 nm;柱温:25℃;梯度洗脱:0～7 min，100%A，7～10 min由100%水到95%A，10～30 min由95%水到75%A，30～35 min由75%A 到0%A;进样量:20 μL。

质谱条件:ABI公司API 3000串联质谱仪;数据采集在正离子模式下采用多反应监测模式(MRM);流速:0.15 mL/min(分流模式);离子源电压5 000 V;离子源温度350℃;Q1和Q3均采用unit分辨率且扫描时间为200 ms，雾化气:14 L/min;气帘气:12 L/min;辅助干燥气:4 L/min;碰撞气:3 mTorr。

2.4 数据分析与统计

紫外和质谱数据峰面积提取后采用外标准曲线定量。数据用Excel进行统计分析，统计结果以±s表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，由方差齐性检验结果选择方差齐或不齐。最后将处理后数据导入SIMCA－P(V11.5，Umetrics)中进行主成分聚类分析。

3 结果与分析

3.1 代谢物含量测定

本实验室采用紫外–串联质谱检测器开发了一种同时定量上述9种嘌呤嘧啶类代谢物的方法［8］。为了获得更好的检测限及灵敏度，根据各个代谢物在紫外和质谱检测器上的灵敏度和稳定性决定检测器的选择。经过对比分析发现尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤采用紫外定量较合适，而其他6种代谢物采用质谱定量更合适，本实验亦采用上述方法。典型的IGT患者血清色谱和质谱图如图1所示。

3.2 IGT临床转化对比

根据世界卫生组织1999年对IGT和糖尿病的血糖诊断标准对61例IGT患者给药前后血糖值进行统计，结果见表1。表1结果表明，生活方式干预和药物干预对IGT的转化均能取得较明显的效果。在给药前和给药6个月后将安慰剂组和给药组的空腹及餐后2h血糖值对比，结果发现给药组在配合生活方式干预的基础上转化为正常血糖的比例明显高于生活方式+安慰剂组，其中尤以餐后2 h血糖变化更为显著(P＜0.015)，治疗总有效性也高于生活方式+安慰剂组，而两者转化为糖尿病的比例相当。

图19种代谢物紫外图(A)和质谱图(B)Fig.1 UV chromatogram(A)and multiple extracted ion chromatograms(B)of nine metabolites

表1 安慰剂组及给药组给药6个月后血糖转化情况，例(%)Tab.1 The conversions of glucose between placebo group and treated group after 6 months＇medication administration/例(%)

3.3 几种差异代谢物给药前后比较

研究表明，糖尿病前期尿酸水平与胰岛素抵抗及肌酐清除率关系紧密［9－11］。本实验从定量的9种嘌呤嘧啶类代谢物的横断面统计分析结果来看，共发现3种代谢物与糖尿病前期IGT患者相关性较大，分别是尿酸、黄嘌呤、肌酐。实验还发现尿酸与肌酐清除率呈负相关，这与文献［9］报道一致，其他6种代谢物与正常组相比差异性较小。表2、表3、表4分别统计分析了给药前、给药3个月及给药6个月后差异代谢物的含量变化。表2结果显示:给药前，正常组比给药组及安慰剂组尿酸水平高。给药后，与正常组比较，安慰剂组及给药组尿酸水平均有向正常组靠拢的趋势，但给药组变化趋势优于安慰剂组。表3结果显示给药前黄嘌呤比正常人有较明显的升高，给药后与尿酸呈现相同的变化趋势，即向正常组靠拢。表4结果显示给药前安慰剂组和给药组与正常组相比血清肌酐含量仅有细微变化，给药后血清肌酐水平亦没有明显变化。此外，实验中我们还发现IGT患者血尿酸氮(BUN)也维持在正常水平，因此从这两者的结果提示IGT患者肾脏功能并无损伤，如文献［9－10］报道血清肌酐的细微变化可能与胰岛素抵抗等其他因素有关。此外，从结果发现各组间标准差相对较大，这可能与个体差异和药物对个体干预的效果不同等因素有关。

表2 给药后对尿酸代谢的影响(±s)Tab.2 The impact of uric acid metabolism after medication administration(¯x ± s)

表2 给药后对尿酸代谢的影响(±s)Tab.2 The impact of uric acid metabolism after medication administration(¯x ± s)

注:与生活方式+给药组给药6个月相比，*P ＜0.02，***P＜0.1;与生活方式+给药组给药前相比，**P ＜0.002。

分组 例数 给药前/(μg/mL)给药3个月/(μg/mL)给药6个月/(μg/mL)生活方式+安慰剂组32 30.29±13.38 32.25±13.49 38.00±10.17*生活方式+给药组29 30.16±12.77 36.91±12.06 42.83±10.58**正常组 19 48.93±8.98***— —

表3 给药后对黄嘌呤代谢的影响(±s)Tab.3 The impact of xanthine metabolism after medication administration(¯x ± s)

表3 给药后对黄嘌呤代谢的影响(±s)Tab.3 The impact of xanthine metabolism after medication administration(¯x ± s)

注:与生活方式+给药组给药6个月相比，*P ＜0.1，***P＜0.005;与生活方式+给药组给药前相比，**P ＜0.01。

分组 例数 给药前/(μg/mL)给药3个月/(μg/mL)给药6个月/(μg/mL)生活方式+安慰剂组32 0.428±0.101 0.353±0.104 0.325±0.102*生活方式+给药组29 0.442±0.104 0.324±0.103 0.312±0.085**正常组 190.184±0.083***— —

表4 给药后对肌酐代谢的影响(±s)Tab.4 The impact of creatinine metabolism after medication administration(¯x ± s)

表4 给药后对肌酐代谢的影响(±s)Tab.4 The impact of creatinine metabolism after medication administration(¯x ± s)

注:与生活方式+给药组给药6个月相比，*P ＜0.2，***P ＜0.1;与生活方式+给药组给药前相比，**P ＜0.1。

分组 例数 给药前/(μg/mL)给药3个月/(μg/mL)给药6个月/(μg/mL)生活方式+安慰剂组32 6.685±1.549 6.805±1.184 6.706±1.135*生活方式+给药组29 6.441±1.436 6.577±1.8946.501±1.774**正常组 19 7.249±0.953***— —

3.4 药物干预主成分聚类分析

鉴于个体差异及药物对不同个体的干预效果不同，笔者还采用主成分分析法(PCA)对给药前后的整体性趋势进行评价。图2是正常组及给药组在给药前、给药3个月、给药6个月主成分分析(PCA)得到的得分矩阵三维空间投影图。其中的主成分包括9种代谢物及空腹和餐后2h血糖值。从图2可以看出:四个组在空间中能明显聚成4类但又紧密相连。此外，从图2中还能明显看出随着给药的进行，给药3个月及给药6个月均有向正常组靠近的趋势，且随着给药时间的延长靠拢的趋势越明显。图中结果提示嘌呤嘧啶代谢循环与糖尿病前期糖耐量受损有着密切的关联。通过给药前后的聚类对比分析我们推测天芪胶囊对糖尿病前期嘌呤嘧啶代谢循环具有较好的干预作用。

图2 正常组与给药组PCA投影图Fig.2 The projection of PCA for normal group and treatment group

4 讨论

长期以来，尿酸水平与糖尿病的关系一直存在着两种截然相反的结论—高尿酸血症与低尿酸血症。近年来通过大量样本的统计回归分析发现高尿酸血症与低尿酸血症是糖尿病的两种不同表型，糖尿病患者在早期无并发症时，血尿酸水平降低，而当发展到存在并发症时，血尿酸水平明显升高［9］。此外，研究还发现在糖尿病早期胰岛素抵抗明显升高，同时血尿酸水平与胰岛素抵抗值及肌酐清除率呈负相关［10］。从本实验横断面的分析结果来看，嘌呤嘧啶代谢循环尤其是尿酸与糖耐量受损有较大的关联。在此研究中我们发现糖尿病前期IGT患者尿酸及肌酐水平均有不同程度的降低，这也与上述糖尿病患者在患病早期的相关报道吻合，因此不难发现IGT患者嘌呤嘧啶代谢可能与糖尿病早期无并发症时相似，其尿酸和肌酐降低可能和胰岛素抵抗作用下高血糖和高尿糖在肾近曲小管竞争，抑制尿酸和肌酐的重吸收，使尿酸和肌酐排泄增加有关。此外，我们还发现IGT患者血清黄嘌呤升高明显，这也提示IGT患者可能由于嘌呤嘧啶代谢紊乱导致黄嘌呤的生成增加或黄嘌呤氧化酶活性降低，进而导致黄嘌呤代谢紊乱产生低血尿酸。

目前，通过临床及大鼠实验已经发现天芪胶囊在调节血糖和血脂方面具有较好的疗效。蔡寒青等［12］发现天芪降糖胶囊对胰岛素及C－肽的分泌无明显影响，可能通过改善靶细胞对胰岛素的敏感性来发挥降糖作用。张茜等［13］利用基因芯片发现天芪降糖胶囊能明显改善KKAy小鼠胰岛素抵抗和脂代谢紊乱，他们还推测可能是通过 AMPKP38MAPK－GLUT4通路来改善葡萄糖的利用而达到降糖作用。从本实验给药前及给药后TG、TC、HDL、LDL观察结果我们发现亦能得到与文献报道相似的结果。本研究旨在从嘌呤嘧啶代谢循环的角度考察天芪胶囊对IGT患者的干预作用。实验发现天芪降糖胶囊对血糖及嘌呤嘧啶代谢循环具有较好的干预作用。在配合生活方式干预的基础上给药组尿酸、黄嘌呤等差异较显著的代谢物均有向正常组转化的趋势。结合文献报道及上述横断面和给药的结果我们推测天芪降糖胶囊的降糖机制在改善嘌呤嘧啶代谢上可能与降低胰岛素抵抗、增强胰岛素敏感性促进机体对葡萄糖的利用等因素有关。

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