p38MAPK活化在苦参碱诱导Raji细胞凋亡中作用的研究

刘占术， 罗章琴， 张红宾， 陈建斌*， 杨泽松， 黄 曦， 黄宗干

(1.重庆医科大学附属永川医院血液内科，重庆 402160;2.重庆医科大学附属第一医院血液内科，重庆 400016;3.重庆市合川区人民医院肿瘤血液中心，重庆 401520)

细胞为研究对象，探讨苦参碱在诱导Raji细胞凋亡过程中对凋亡信号转导通路交汇点的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase ，p38MAPK)的影响。

1 材料与方法

1.1 药物 苦参碱由吉林玉皇药业有限公司生产，分 子量 248.36，批 准文 号:国 药准 字H20031000，产品批号:20080908，5mL:50mg，4℃ 保存。

1.2 主要试剂与器材 Annexin V－FITC/PI双标记染色试剂盒、蛋白提取试剂盒以及ECL发光试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);P－p38MAPK与Caspase－3抗体(北京博奥森生物技术有限公司);β－actin抗体以及羊抗兔IgG二抗(武汉博士德生物工程有限公司);BCA试剂盒以及SB203580(碧云天生物技术研究所);FACStar－plus型流式细胞仪(BD公司，美国)，凝胶图像分析仪(Bio－Rad公司，美国)。

1.3 细胞 Raji细胞株由重庆医科大学附属儿童医院惠赠。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 Raji细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，另加青霉素和链霉素各100U/mL，于37℃、5%CO2的饱和湿度的孵箱中培养，2－3d换液传代1次。取对数生长期细胞进行实验。

1.4.2 AnnexinV－FITC/PI双标记染色检测Raji细胞凋亡率 根据本课题前期实验研究［5］，收集对数生长期细胞，调整细胞密度为2×105个/mL，接种于7个100 mL的培养瓶进行培养，取其中3个培养瓶加入苦参碱(终浓度为0.4 mg/mL，0.8 mg/mL，1.6 mg/mL)，再取3个培养瓶先加入10μmol/L SB203580 1 h后加入苦参碱(终浓度同上)，并设立对照组，作用Raji细胞48 h后，2 000 r/min，离心5 min，4℃预冷的 PBS洗涤2次，收集细胞后，按照

AnnexinV－FITC/PI双标记染色参考试剂盒说明书操作，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.4.3 Western blot检测 P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白表达量的变化 细胞处理同上，每组收集1×107个以上细胞，用预冷的PBS洗涤3次，3 000 r/min，5 min后，弃上清，然后按照蛋白提取试剂盒说明进行操作，最终得到蛋白提取物。用BCA法测定蛋白浓度，取总蛋白30μg，算出每组的上样量后加入配好的10%SDS－PAGE进行凝胶电泳(浓缩胶:60 V，30 min;分离胶:100 V，1 h)分离目的蛋白;然后在250 mA，1 h条件下将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用含5 g脱脂奶粉的TBST 100 mL，室温封闭2 h;分别加1∶200稀释的兔抗人P－p38MAPK和1∶100稀释的Caspase－3抗体，4℃孵育过夜，用TBST漂洗10 min×3次;加1∶3 000稀释的过氧化物酶结合的二抗，室温孵育2 h;用TBST漂洗10 min×3次，然后进行ECL发光，用凝胶图像分析仪曝光拍照。将硝酸纤维素膜用洗脱液漂洗1 h以去除上一次结合的抗体，再分别与1∶500稀释的抗βactin抗体4℃孵育，漂洗，孵育二抗再漂洗后，扫描蛋白印迹条带。实验重复3次。采用Quantity One分析软件对目的蛋白条带进行灰度扫描，结果用目的蛋白/β－actin灰度值之比表示。

2 结果

2.1 苦参碱对Raji细胞凋亡的影响0.4、0.8、1.6 mg/mL

苦参碱作用Raji细胞48 h后，其总凋亡率分别为(15.77±0.53)%、(27.88±1.52)%、(48.08±2.87)%，与加入SB203580比较(11.48±0.64)%、(19.34±0.91)%、(33.98±1.26)%具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，与对照组(8.78±0.66)%相比较差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01);苦参碱不同浓度组间比较也具有统计差异(P＜0.05，P＜0.01)(见图1、2)。

2.2 苦参碱对 Raji细胞 P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白含量的影响

图1 不同浓度Mat以及在此基础上加入SB203580后诱导Raji细胞凋亡Fig.1 Apoptosis of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580

图2 不同浓度Mat以及在此基础上加入SB203580后诱导Raji细胞凋亡率(¯x ±s，%，n=3)Fig.2 Apoptosis rate of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580(¯x ± s，% ，n=3)

如图3所示，0.4、0.8、1.6 mg/mL苦参碱作用Raji细胞 48h后，P－p38MAPK灰度比值分别为(1.06±0.05)、(1.98±0.07)、(3.43±0.11)，与对照组(0.61±0.04)比较具有统计差异(P＜0.01)，在加入抑制剂后其灰度比值分别为(0.76±0.04)、(1.53±0.06)、(2.60±0.09)，加入抑制剂前后相比较差异显著(P＜0.01);同样，Caspase－3灰度比值分别为(0.53±0.01)、(1.03±0.02)、(1.49±0.02)，与对照组(0.36±0.01)比较有统计差异(P＜0.01)，加入抑制剂后其灰度比值分别为(0.42±0.02)、(0.76±0.02)、(1.12±0.02)，加入抑制剂前后相比较也具有明显差异(P＜0.01)，通过相关性分析，二者明显相关(r=0.944);在苦参碱各浓度组之间，P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白差异显著(P＜0.01)。

图3 各组Raji细胞P-p38MAPK、caspase-3蛋白的表达Fig.3 The expression of P-p38MAPK and caspase-3 protein in every Raji cell groups

3 讨论

Burkitt＇s淋巴瘤是具有高度侵袭性的B细胞肿瘤，目前治疗主要采用大剂量化疗，虽其完全缓解率为75% ～90% ，总生存率达50% ～70%，但因化疗副作用极大和化疗后极易复发［6］，使寻求高效低毒抗肿瘤药物成为必要。最近研究表明［1－5］作为传统中药的苦参碱具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，目前对其机制主要集中在对 p53、Fas、FasL、Bax、Bcl－2 等基因的研究［7－9］，对 p38MAPK 在该机制中的研究较少，本实验以Raji细胞为研究对象，通过检测P－p38MAPK(活化的 p38MAPK)，来证明 P－p38MAPK与苦参碱诱导Raji细胞凋亡的相关性。

p38MAPK信号转导通路是生物信号引起核反应的重要通路，激活的P38MAPK通过磷酸化多种转录因子，调控特定基因表达，导致蛋白合成、细胞表面受体表达、细胞骨架重构，最终导致细胞的凋亡［10］。本研究流式细胞仪结果显示细胞凋亡率随苦参碱的浓度的提高而增加，在加入p38MAPK抑制剂后，凋亡率有所下降，这说明P－p38MAPK与苦参碱诱导Raji细胞凋亡具有相关性。为此，本研究又采用Western blot检测了P－p38MAPK和 Caspase－3蛋白的含量，结果显示随苦参碱浓度的增加，二者表达量均增加，在加入p38MAPK抑制剂后，二者表达降低，这与细胞凋亡率的结果一致，同时，相关性分析结果也显示 P－p38MAPK与 Caspase－3明显相关，这在Wang等［6］的研究中也得到证实。

目前p38MAPK通路与细胞凋亡的机制尚不清楚，Wang 等［11］发现 Fas－放线菌素 D 诱导 Bel－7402细胞凋亡是通过p38MAPK在细胞核与Caspase－3结合后激活 Caspase－3实现的。张玉军等［12］却发现p38MAPK上调Fas/FasL导致Caspase－3活化，促进细胞凋亡，因此推测p38MAPK在凋亡过程中具有双重作用，但最后凋亡的执行都是由活化的Caspase－3 完成的。

综上所述，我们研究表明苦参碱可通过激活p38MAPK来直接或间接激活Caspase－3蛋白，进而使Raji细胞凋亡，该机制的阐明为苦参碱抗肿瘤作用提供充分的理论依据。

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