六味地黄生物制剂对残疾果蝇寿命的影响

2011-05-26夏少秋

中成药 2011年3期

朱颖，夏少秋，赵越

(广东药学院中药学院广东广州 510006)

果蝇衰老的进程中会出现触角、足以及部分翅膀的损伤，而这些损伤会造成血淋巴的丢失，血淋巴含有水和营养物质，这些物质可能对果蝇生存有很重要的作用［1］。本实验通过手术方法，人为地对果蝇的中足造成损伤，这有可能使这些残疾的果蝇比正常的果蝇弱势，甚至有可能使果蝇提前进入衰老状态。再用六味地黄生物制剂喂饲这些损伤的果蝇，考察其能否延缓衰老。

六味地黄汤(Liuwei Dihuang Decoction，简称LW)是滋阴补肾、固本养生的经典之方，历经千年而不衰。LW主要用于治疗肝肾阴虚、腰膝酸软、头晕目眩、耳鸣耳聋、遗精、消渴等肾阴不足之证［2］。现代药理研究表明［3］，该方在调节免疫、抗衰老方面有很好的作用，并对内分泌系统有明显的影响，临床用于更年期综合症［4］，同时临床上也用于治疗骨折迟缓愈合［5］。六味地黄生物制剂(LW－PSB)是利用光合细菌代谢六味地黄汤，通过光合细菌的生物转化功能和自身营养价值的利用，制备出的现代制剂。它是一种经过微生物发酵而形成的含有光合细菌菌体蛋白及其代谢分泌物、培养基和中草药发酵物的混合物，不但比传统的六味地黄汤有更强抗衰老作用［6］，而且营养也更丰富。

1 方法和材料

1.1 器材与试剂

白砂糖、琼脂、玉米粉、酵母粉(均为食品级);恒温生化培养箱BOXUN SPX－250B－Z型(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)等。

1.2 六味地黄生物制剂的制备

熟地黄，批号 060125;山茱萸(制)，批号060112;山药，批号051228;牡丹皮，批号051206;茯苓，批号051219;泽泻，批号051209。药材均购自广州致信药业有限公司，经广东药学院药用植物学与中药鉴定学教研室鉴定，均符合药典规定。熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮、茯苓按处方的比例(8∶4∶4∶3∶3∶3)配药。加8倍量的水，经自然发酵3个月后，浓缩至0.5 g/mL，再按一定比例加入光合细菌代谢6个月即得。

1.3 培养基的制备

1.3.1 普通培养基制备:水180 mL，白糖13 g，琼脂1.3 g，玉米粉17 g，酵母粉1.4 g，丙酸1 mL。

1.3.2 含药培养基制备:分别取 LW－PSB 0.1 g，0.2 g加入到100 g普通培养基中，得到质量浓度为0.1%、0.2%的含药培养基。

1.4 动物

美国野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，购自华南农业大学生命科学院。温度为(25±1)℃，相对湿度为(30±5)% 环境，12 h光照，12 h黑暗交替培养。

1.5 实验方法

1.5.1 交配实验收集8 h内新羽化雌雄黑腹果蝇成虫，低温麻醉，做如下处理［1］:Ⅰ剪去雌性果蝇两侧中足足尖;Ⅱ剪去雄性果蝇两侧中足足尖;Ⅲ剪去雌性果蝇一侧整个中足;Ⅳ剪去雄性果蝇一侧整个中足;Ⅴ正常的雌性果蝇;Ⅵ正常的雄性果蝇。每组10只果蝇，普通培养基饲养20 d。于第21天让雌雄交配，交配方法:(1)为Ⅰ和Ⅱ交配;(2)为Ⅲ和Ⅳ交配;(3)为Ⅴ和Ⅵ交配。从合并开始计时，记录11 min内、22 min内、33 min内、44 min内交配的总数。每组重复实验10次。

1.5.2 耐寒实验收集8 h内新羽化雌雄黑腹果蝇成虫，低温麻醉，做如下处理:Ⅰ剪去雌雄果蝇两侧中足足尖;Ⅱ剪去雌雄果蝇一侧整个中足;Ⅲ不做任何处理。每组100只果蝇，雌雄各半。普通培养基饲养10 d。于第11天移入空的三角瓶中，置于－5℃环境中4.5 h，再与室温下(14℃)复活6 h，观察果蝇存活只数。每组重复实验10次。

1.5.3 攀爬实验收集8 h内新羽化雌雄果蝇成虫，低温麻醉，果蝇处理方法同1.5.2项。每组100只果蝇，雌雄各半。普通培养基饲养30 d。于第30天移入空的三角瓶中，再在其上覆盖一个空的三角瓶，观察30 min内攀爬上覆盖瓶中的果蝇只数。每组重复实验10次。

1.5.4 寿命实验收集8 h内新羽化黑腹雄性果蝇成虫，低温麻醉，做如下处理:Ⅰ剪去雌雄果蝇两侧中足足尖;Ⅱ剪去雌雄果蝇一侧整个中足。每2天更换新鲜培养基。实验开始后，每天定点观察，记录果蝇死亡数，直到各组果蝇全部死亡为止。前一半死亡的果蝇的寿命的算术平均数为半数死亡时间，全部果蝇寿命的算术平均数为平均寿命，最后10只果蝇寿命的算术平均数为最高寿命，平均延寿率(%)=(给药组平均寿命－空白对照组平均寿命)/空白对照组平均寿命×100%。统计各组果蝇半数死亡时间，平均寿命，最高寿命和平均延寿率。

1.6 统计方法

采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 交配实验

从表1可知，前11 min，组Ⅰ与组Ⅲ比较，组Ⅰ的交配能力明显弱于组Ⅲ(P＜0.05);从22 min到44 min，组Ⅰ，组Ⅱ的交配能力均比组Ⅲ能力弱，且差异有显著性意义(P＜0.05，P＜0.01)。这可能与果蝇腿损伤后，行动不便有关，还有与果蝇的交配方式有关。

2.2 耐寒实验

从表2可知，组Ⅰ雌雄果蝇存活数量均少于组Ⅲ，且差异有显著性意义(P＜0.01)，平均存活率只有14.8%和15.2%。组Ⅱ雌雄果蝇存活数量也均少于组Ⅲ，均有显著性差异(P＜0.01)，平均存活率只有15.6%和14.6%。而组Ⅰ和组Ⅱ没有显著性差异，其存活率均没有达到组Ⅲ的一半。说明损伤果蝇抵御低温的能力比正常的果蝇的低，可能是损伤引起内分泌失调，导致果蝇的耐寒能力下降。

表1 损伤对果蝇交配行为的影响(±s)Tab.1 Effect of injury on coputatory bebavior in Drosophila melanogaster(¯x ± s)

与GroupⅢ比较，*P ＜0.05;与 GroupⅢ比较，**P ＜0.01，与GroupⅢ比较，***P ＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅢ;**P＜0.01 vs GroupⅢ;***P＜0.001 vs GroupⅢ.

组别交配对数/对11 min 22 min 33 min 44 minⅠ 0.71±0.49* 1.29±1.11**1.86±1.21**2.43±1.40*1.71±0.95 2.86±0.69 3.86±1.07 4.14±0.90Ⅱ 1.00±0.82 1.71±0.76* 2.00±1.00**2.71±1.11*Ⅲ

表2 损伤对果蝇耐寒能力的影响(±s)Tab.2 Effect of injury on cold－resistant competence in Drosophila melanogaster(¯x ± s)

与GroupⅢ比较，*P＜0.05;与 GroupⅢ比较，**P＜0.01;与GroupⅢ比较，***P ＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅢ;**P＜0.01vs GroupⅢ;***P＜0.001vs GroupⅢ。

组别存活数/只平均存活率/%♀♂♀♂Ⅰ 7.20±6.81**7.60±6.99**14.8 15.2Ⅱ 7.30±6.37**7.60±6.55** 15.6 14.6Ⅲ18.20±9.53 19.20±9.24 34.0 38.6

2.3 攀爬实验

从表3可知，组Ⅰ，组Ⅱ与组Ⅲ比较均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，说明损伤能减弱果蝇的攀爬能力。

表3 损伤对果蝇攀爬能力的影响(±s)Tab.3 Effect of injury on climbing capability in Drosophila melanogaster(¯x ± s)

与GroupⅢ比较，*P＜0.05;与 GroupⅢ比较，**P＜0.01;与GroupⅢ比较，***P ＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅢ;**P＜0.01 vs GroupⅢ;***P＜0.001vs GroupⅢ。

组别攀爬数/只平均攀爬率/%♀♂♀♂Ⅰ 10.83±5.11**13.83±4.45***21.7 27.7Ⅱ 13.33±3.88* 13.00±4.69*** 26.7 19.3Ⅲ22.00±7.95 29.33±7.58 44.0 58.7

2.4 寿命实验

由表4可知，组Ⅰ中，雌性果蝇经口喂饲质量浓度0.1%、0.2%LW－PSB后，其半数死亡时间，平均寿命，最高寿命均高于喂饲普通培养基雌性果蝇(P＜0.001)，其平均延寿率分别达到29.7%、40.7%。雄性果蝇喂饲质量浓度0.2%LW－PSB后，其数死亡时间，平均寿命，最高寿命均高于喂饲普通培养基雄性果蝇(P＜0.01，P＜0.001)，其平均延寿率为44.8%，而0.1%浓度仅能提高半数死亡时间和最高寿命(P＜0.05，P＜0.001)，对平均寿命没有显著影响。

组Ⅱ中，当质量浓度为0.1%时，雌性果蝇的半数死亡时间，平均寿命，最高寿命均高于空白对照组(P＜0.01，P＜0.001);而雄性果蝇的仅半数死亡时间高于空白对照组(P＜0.001)。当质量浓度为0.2%时，雌性果蝇的平均寿命和最高寿命均高于空白对照组(P＜0.01，P＜0.001);雄性果蝇半数死亡时间和平均寿命均高于空白对照组(P＜0.001)。另外，随着LW－PSB浓度的增加，抗衰老的效果也有增加的趋势。

表4 六味地黄生物制剂对残疾果蝇寿命的影响(±s)Tab.4 Effect of LW-PSB on life-span in Drosophila melanogaster(¯x ± s)

与GroupⅠ中空白对照组比较，*P＜0.05;与GroupⅠ中空白对照组比较，**P＜0.01;与 GroupⅠ中空白对照组比较，***P＜0.001。与GroupⅡ中空白对照组比较，#P＜0.05;与 GroupⅡ中空白对照组比较，##P＜0.01;与 GroupⅡ中空白对照组比较，###P＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅠcontrol group;**P＜0.01 vs GroupⅠcontrol group;***P＜0.001 vs GroupⅠcontrol group;#P＜0.05 vs GroupⅡcontrol group;##P＜0.01 vs GroupⅡcontrol group;###P ＜0.001 vs GroupⅡcontrol group。

组别 LW－PSB质量浓度/% 性别数量/只半数死亡时间/d 平均寿命/d 最高寿命/d 平均延寿率/%Ⅰ59.90±1.07 24.2 100 19.30±3.64 27.88±10.34 47.30±3.27♂ 100 17.21±4.73 33.95±17.29 50.30±3.40 0.1 ♀ 100 24.70 ±5.67*** 36.17±12.92*** 56.20±3.55*** 29.7♂ 100 28.81±13.19*** 39.02±10.90 56.60±1.26* 14.9 0.2 ♀ 100 27.14±6.57*** 39.22±13.76*** 61.00±1.76*** 40.7♂ 100 32.28±11.57*** 49.17±16.24** 58.10±1.19*** 44.8Ⅱ0♀ 100 25.22±7.57 33.12±9.87 46.60±3.03♂98 20.59±7.90 38.67±19.04 58.90±0.32 0.1 ♀ 100 34.08±9.65### 37.67±13.09## 57.00±1.49### 13.7♂ 100 29.60±13.05### 42.67±16.45 59.20±0.42 10.3 0.2 ♀ 100 26.30±7.03 42.57±11.35## 58.30±1.77### 28.5♂ 100 41.51±10.63### 48.04±10.34###0♀

3 讨论

从表1～3可以得出，这两种残疾模型的果蝇无论是交配能力，耐寒能力或者攀爬的能力都不及正常的果蝇，而且都显示出显著性差异(P＜0.05)。这些人为的伤害直接使果蝇行动不便，也可能直接或间接得使果蝇的代谢方面产生变化，使得它们行为能力的降低。然后将质量浓度为0.1%、0.2%的LW－PSB喂饲这两种模型的残疾果蝇，从表4可以看出，LW－PSB起到了很好的延缓衰老的作用，显著延长了残疾果蝇的半数死亡时间，平均寿命，最高寿命(P＜0.05)。LW－PSB可以扭转残疾果蝇的弱势状态，延长其寿命，提高其生命活力。果蝇在衰老过程中出现的一些行为能力的改变和功能下降，由很多解释［7］。本试验认为LW既然有促进骨折愈合，调节内分泌等作用，那么LW－PSB可能主要是直接促进残疾果蝇足部伤口愈合，调节其内分泌从而改善残疾果蝇的代谢情况，通过这两个方面而起到延长寿命，延缓衰老的作用。

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