轮作与连作烟田根际土壤酸性有机组分的初步分离与鉴定

符建国，易建华，贾志红,*，苏以荣

（1.湖南中烟工业有限责任公司，长沙 410007；2.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，长沙 410125）

烤烟是我国重要的经济作物，为国家带来巨大的经济效益。随着烤烟生产规模的扩大，由于耕地所限，在许多地区烤烟种植不得不采用连作方式，但长期连作会引起连作障碍。连作或重迎茬障碍的原因主要有三方面，病虫害、土壤营养失调、根系及根际微生物产生的有毒物质[1]。关于连作大豆、蔬菜或果树土壤中产生的有机化合物或化感物质种类及数量的，相关文献报道较多[2-9]，而关于烤烟土壤有机化合物或化感物质报道较少。探明连作和轮作土壤中化感物质种类及数量，对深入研究烤烟土壤有机化合物或化感作用，揭示有机化合物或化感物质对土壤生物及土壤环境的影响具有重要的意义。笔者应用定性与相对定量分析技术（GC/MS），初步鉴定了轮作与连作植烟土壤中几种有机化合物或化感物质种类，以期为研究烤烟土壤化感物质的种类和数量及在烤烟连作障碍中的作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验于2007—2008年在湖南浏阳市东区进行。地貌类型为典型的南方丘陵山区，东经113°52′，北纬 28°22′，海拔 103 m，年均气温 17.3 ℃，≥10 ℃的积温241.6 d，活动积温为5477.4 ℃，降水量1601 mm，年平均蒸发量1204 mm，无霜期271.8 d，多年平均风速1.4 m/s，日照时数1845.0 h，土壤类型为水稻土，土壤质地为壤土，土壤养分状况见表1。耕层厚度30 cm左右，农业灌溉井渠双配套。

表1 烟区土壤养分状况Table1 Soil nutrient contents in tobacco growing area

1.2 样品采集和制备

于烤烟旺长期（2007年5月15日），分别在连作（＞5年）和轮作烤烟地随机选取样地，每一耕作方式选择3块样地，每一样地按“蛇形法”随机选5株健康烤烟，采集根际混合样品装袋，迅速带回实验室，低温保存备用。

土壤酸性有机化合物的提取：取过 40目筛土壤125 g，加入500 mL 80%甲醇振荡（振荡频率为160次/min，温度25 ℃）提取2 h，离心（3500转/min，20 min，25 ℃）、过滤后获得澄清滤液，残渣弃去。将滤液减压浓缩，获浓缩液约100 m1。将浓缩液用浓盐酸调pH至3.0，用乙酸乙酯萃取其中性、酸性有机化合物（每次25 mL，萃取3次），得水相1、乙酸乙酯相1。将水相1用NaOH调pH至10，每次100 mL乙酸乙酯萃取3次，得水相2(弃去)、乙酸乙酯相2，乙酸乙酯相2即为碱性组分。对乙酸乙酯相1用100 mL pH 10的8%NaOH萃取(每次100 mL，萃取3次)，得水相3、乙酸乙酯相3。对水相3调pH至3.0，每次100 mL乙酸乙酯萃取3次，得水相4(弃去)、乙酸乙酯相4，乙酸乙酯相4即为酸性组分。对酸性组分减压浓缩至100 mL，每毫升含从 5 g土壤中提取的有机化合物，计作 5 g/mL)，用于生物检测和GC/MS鉴定。

1.3 提取液有机化合物的GC-MS 分析

土壤酸性组分的硅烷化：取一定量上述土壤酸性组分提取液进行硅烷化处理。方法是将提取液浓缩至干后，加入250 µL硅烷化试剂（BSTFA：吡啶=5∶1），加盖密封，在75～80 ℃水浴中加热1 h。

土壤酸、中、碱性组分的 GC/MS分析：将处理好的各组分提取液进行GC/MS分析。

色谱条件：毛细管柱为HP-5（Crosslinked 5%pH ME Siloxanle，30 m×0.25 mm×0.25 µm）；进样口温度250 ℃；程序升温：柱温 50℃（2 min），以6 ℃/min程序升温至250 ℃（保持15 min）；载气为He；流速为1.0 mL/min。

质谱条件：EI源（电子轰击源），轰击电压70 eV，扫描范围m/z；30～600 amu，扫描速度0.2 s 扫全程，离子源温度：200 ℃，四级杆温度150 ℃。进样量为1 µL。不分流进样。通过质谱分析和计算机标准谱库检索，并采用峰面积归一化法（JY/T003—1996）确定各化合物的相对百分含量。

2 结果与讨论

连作和轮作前后土壤萃取产物的气相色谱-质谱总离子流图见图 1。各色谱峰相应的质谱图经人工解析及计算机检索，确定其化学结构，共鉴定出21种化合物，并利用面积归一化法，测定出相对含量，结果见表2。

图1 烤烟根际土壤有机化合物酸性组分种类及含量Fig.1 Types and contents of organic compounds in tobacco rhizosphere soil

表2 连作和轮作烤烟根际土壤有机化合物酸性组分种类及含量Table2 Types and contents of acid components of organic compounds in tobacco rhizospheric soil in monocropping and rotation

从表2可以看出，在所检出的21种成分中，主要为醇类、酸类、酯类及酞酸酯类四大类物质。连作和轮作前土壤酸性组分分别有18和19种，醇类物质为丙三醇，酸类物质为苯甲酸、十二酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、十四酸、油酸、亚油酸和十八酸，酯类物质为十四酸异丁酯、十六酸异丁酯、十六酸丁酯、十八酸异丁酯、十八酸丁酯，酞酸酯类物质为邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁基异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异辛酯，其中连作比轮作多一种成分，为苯甲酸。连作和轮作后，土壤酸性组分发生了种类和数量的变化，连作土壤有 11种，轮作土壤有 12种，连作和轮作土壤醇类物质没有变化，仍为丙三醇，其它组分均发生变化。连作土壤酸类物质中没有检测到对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸和十四酸，而检测到增加物质对苯二甲酸，轮作土壤酸类物质中没有检测到邻苯二甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，而检测到增加物质对苯二甲酸。连作和轮作后土壤酯类物质中均没有检测到十四酸异丁酯、十六酸异丁酯、十六酸丁酯、十八酸异丁酯和十八酸丁酯，而检测到增加物质十六酸甲酯。连作后土壤酞酸酯类物质中没有检测到邻苯二甲酸二丁基异丁酯，而轮作后土壤酞酸酯类物质中没有检测到邻苯二甲酸二丁基异丁酯和邻苯二甲酸二丁酯。

由表2还可看出，连作和轮作前，连作土壤醇类成分含量与轮作土壤相同，连作土壤酸类和酯类物质含量小于轮作，连作酞酸酯类物质成分含量大于轮作。连作和轮作后，连作土壤醇类和酞酸酯类物质含量小于轮作土壤，而酸类和酯类物质含量大于轮作土壤。连作和轮作土壤酸性有机组分中，大部分物质为已经报道的化感物质。邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸化感作用已大量报道，均在一定浓度下抑制植株幼苗的生长[10-11]。长链脂肪酸豆蔻酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸等是已被鉴定起杀菌及抑制高等植物生长作用的长链脂肪酸[1]。酞酸酯类是环境污染物，常用来作为塑料增塑剂，当前农业生产中大量使用塑料地膜，便是土壤中酞酸酯类物质大量存在的原因。酞酸酯类物质对植物生长不良影响虽然比苯甲酸较小，但如果在环境中达到一定浓度，将会明显抑制烤烟早期生长[12-14]。对苯二甲酸可能是环境污染物，未有报道表明其对植物生长的影响。从本试验结果还可知，连作和轮作土壤中存在多种化感物质，而化感物质的化感效应具有叠加性，其化学作用往往是由多种化感物质协同作用而对植物化感作用增强[2]。连作障碍使土壤理化特性恶化，病虫害增加有可能是这些多种有机化合物或化感物质共同作用的。

由表3可以看出连作和轮作前后土壤有机化合物种类及含量发生的变化。醇类、酸类和酯类物质在种植后含量均增加，而酞酸酯类物质在减少。连作和轮作后，土壤醇类、酸类和酯类物质均增加了90%以上，而酞酸酯类物质减少了75%以上。由此可以推测，土壤酸性有机组分中酸类物质含量的增加可能是植烟土壤酸化并造成连作障碍的一个原因。

表3 不同种植方式植烟土壤有机化合物种类及相对含量 %Table3 Types and contents of soil organic compounds in different tobacco growing patterns

3 结 论

采用气相色谱质谱联用方法对轮作和连作土壤中酸性组分的初步分离与鉴定，结果显示，两种不同种植模式（轮作和连作）土壤酸性有机组分中包含有醇类、酸类、酯类和酞酸酯类等物质，这些物质化学组分中大部分均已被报道为化感物质。轮作和连作土壤酸性组分中各类物质相对含量有所差别，其化学成分也有明显差别。几种重要的化感物质在种植前后发生了增加或消减变化，有可能由于该物质气化后含量极其微量而没有检测到。如酸类物质苯甲酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸和十四酸，酞酸酯类物质邻苯二甲酸二丁酯。不论哪种种植模式，植烟后，环境污染物酞酸酯类含量相对降低，酸类和酯类物质含量相对增加，在酸类物质和酯类物质不断转换的化学过程中，又出现了一种新的环境污染物对苯二甲酸。

[1]Rice E L.Allelopathy[M].New York∶ Academic Press Inc, 1984.

[2]孔垂华，胡飞.植物化感相生相克作用及其应用[M].北京：中国农业出版社，2001.

[3]俞慎，何振立，陈国潮，等.不同树龄茶树根层土壤化学特性及其对微生物区系和数量的影响[J].土壤学报，2003，40（3）：433-439.

[4]陆雅海，张福锁.根际微生物研究进展[J].土壤，2006，38（2）：113-121.

[5]Wang F, Bian Y R, Jiang X, et al.Residual characteristics of organochlorine pesticides in lou soils with different fertilization modes[J].Pedosphere，2006，16(2)：161-168.

[6]韩丽梅，沈其荣，鞠会艳.大豆地上部水浸液的化感作用及化感物质的鉴定[J].生态学报，2002，22（9）：1425-1432.

[7]郁继华，张韵，牛彩霞，等.两种化感物质对茄子幼苗光合作用及叶绿素荧光参数的影响[J].应用生态学报，2006，17（9）：1629-1632.

[8]Singh H P，Batishi D R，Kohli R K.Autotoxicity∶Significance [J].Crit.Rev.Plant Sci.，1999，18∶ 757-772.

[9]张新慧，张恩和.不同植龄啤酒花根际土壤中有机化合物的初步分离鉴定[J].土壤学报，2009，46（2）：368-371.

[10]阮维斌，刘默涵，潘洁，等.不同饼肥对连作黄瓜生长的影响及其机制初探[J].中国农业科学，2003，36（12）：1519-154.

[11]汪思龙，陈龙池，廖利平，等.几种化感物质对杉木幼苗生长的影响[J].应用与环境生物学报，2002，8（6）：588-591.

[12]王树起，韩丽梅，杨振明.不同有机酸对大豆生长的化感效应[J].大豆科学，2002，21（4）：267-273.

[13]安琼，靳伟，李勇，等.酞酸酯类增塑剂对土壤-作物系统的影响[J].土壤学报，1999，36（1）：118-126.

[14]Jia Z H， Yi J H， Su Y R.Autotoxic substances in the root exudates from continuous tobacco cropping[J].Allelopathy Journal, 2011, 27(1)∶ 87-96.